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多能造血干细胞自我更新的分子基础

多能造血干细胞经过等级分化、发育为淋巴细胞和髓系细胞等多种终末功能细胞,不会因为不断分化而导致干细胞耗尽。这是由于多能造血干细胞具有自我更新(self renewal)潜能,即多能造血干细胞通过自身复制保持干细胞池恒定的潜能。造血细胞长期培养(long term culture)和移植实验结果,提示造血干细胞的自我更新依赖其所在的基质微环境。1978年Schofild根据这些实验结果提出了壁龛(niche)假说,指出壁龛组成于基质细胞,只有壁龛内的造血干细胞才能自我更新。多年来,学术界针对壁龛的结构和功能进行了大量研究,认为哺乳动物骨髓腔内有两种类型壁龛,一种壁龛存在于骨内膜和骨小梁表面,由成骨细胞组成;另一种壁龛存在于血窦周边,组成于血窦内皮细胞。位于骨内膜型壁龛中的造血干细胞可保持静止状态,或根据需求信号进行自身复制和不对称分裂。自身复制产生的两个子细胞均保留在龛中,不对称分裂产生的两个子细胞则有一个分化出龛,另一个仍保留在龛中。位于内皮型壁龛的造血干细胞处于增殖分化状态,能对外周信号迅速反应,大量扩增和分化。造血干细胞在上述两种壁龛间双向迁移,并按照机体对血细胞的需求而定位,既能保证应激状态下外周血液中血细胞的数量,又能保持造血干细胞池恒定。

由成骨细胞及其细胞外基质构成的骨内膜型壁龛,是保证多能造血干细胞池恒定的结构基础。成骨细胞生成和分泌的多种细胞外基质成分和细胞因子,及骨内膜表面的高浓度钙离子,对多能造血干细胞归巢、定位和自身复制进行调控。已知骨内膜表面的钙离子浓度是血清钙离子浓度的30倍,骨髓腔内的钙离子浓度梯度对高表达钙感觉受体(calciumsensing receptor,CaR)的多能造血干细胞的迁移方向和定位有重要作用。Adams等的实验研究发现CaR-/-转基因小鼠骨髓腔中造血干/祖细胞减少,而外周血和脾中造血干细胞相对增多,提示进入骨髓壁龛的造血干细胞减少,可能是导致骨髓中造血干/祖细胞降低的原因。用来源于转基因小鼠的CaR-/-造血干细胞和等量CaR+/+造血干细胞混合做竞争性移植实验。结果证明CaR-/-造血干细胞重建骨髓功能差,黏附1型胶原的能力也降低。1型胶原是成骨细胞的分泌性产物,是骨内膜型壁龛中主要的细胞外基质成分。CaR-/-造血干细胞黏附1型胶原少,提示其在骨内膜型壁龛中的定位也受控于钙离子和钙感觉受体的相互作用。

除1型胶原外,由成骨细胞产生的骨基质蛋白(osteopontin,OPN)是另一个骨内膜型壁龛结构中的细胞外基质成分。OPN通过结合造血干细胞表面受体CD44和整合素分子中的R-G-D序列,而定位造血干细胞于骨内膜型壁龛。Stier和Nilsson等研究组发现OPN与受体结合可引发信号传递,对骨髓中的多能造血干细胞自身复制进行负性调节。作者用流式细胞术分析骨髓中的原始造血干细胞LSK (Lin-Sca-1+c-kit+cells),用细胞培养方法分析骨髓中的长期培养启动细胞(long-term culture initiated cell,LTC-IC),结果OPN-/-转基因小鼠比OPN+/+转基因小鼠有明显增多的LSK细胞群和LTC-IC,证明了OPN对造血干细胞池的大小有负性调节作用。作者又用OPN-/-和OPN+/+骨髓细胞等量混合,输入用致死剂量辐射的小鼠体内,进行竞争性骨髓重建能力的比较。结果来源于OPN-/-转基因小鼠的骨髓细胞有更强的骨髓重建能力,证明OPN-/-转基因小鼠骨髓中的多能造血干细胞用自身复制方式大量增殖。

由成骨细胞生成的血管生成素(angiopoietin,Ang-1)是受体酪氨酸激酶Tie2的配体,而Tie2高表达于多能造血干细胞,Ang-1与Tie2的结合不但能诱导多能造血干细胞定位于骨内膜型壁龛,而且能通过Tie2活化传递信号,导致多能造血干细胞处于静止状态,使之对来自外周的应激需求不反应,从而保存多能造血干细胞于骨内膜型壁龛中。Arai等的实验研究发现小鼠骨髓中的Tie2阳性造血干细胞90%以上为G0期细胞,它们对5-Fu处理导致的外周血细胞需求不发生反应,只有Tie2阴性造血干细胞对5-Fu处理有增殖反应,证明Ang-1/Tie2调节多能造血干细胞的G0生存状态。Nakamura等用基因转染方法制备高表达Ang-1的基质细胞系AHESS-5,再与人CD34阴性造血干细胞共培育。1周后收集细胞输入双免疫缺陷小鼠体内。结果来自Ang-1+ AHESS-5基质细胞组的造血细胞比来自不表达Ang-1的AHESS-5基质细胞组的造血细胞有更强的骨髓重建能力。证明Ang-1对人骨髓中的CD34阴性多能造血干细胞自身复制具有增强作用。

成骨细胞也生成神经钙粘连素(N-cadherin),它与beta-连环素(beta-catenin)形成的黏附连接结构是多种细胞相互粘连的牢固纽带,Calvi等发现成骨细胞表面有神经钙粘连素,而静止的多能造血干细胞表达beta-连环素,也表达神经钙粘连素。作者指出由上述分子形成的黏附连接结构使多能造血干细胞牢固地定位于骨内膜型壁龛。由于神经钙粘连素在成骨细胞和多能造血干细胞表面呈极性分布。作者推测这种极性分布使多能造血干细胞的黏附具有不对称性,可能是多能造血干细胞在骨内膜型壁龛中进行不对称分裂的调节机制。但是这种观点并未得到证实。最近Kiel等的实验研究结果证明缺失神经钙粘连素的多能造血干细胞的增殖分化和归巢能力不受影响。缺失N-cadherin的造血干细胞在连续二次移植中都能重建被辐射损坏的骨髓。可见神经钙粘连素与beta-连环素形成的黏附连接结构只有定位多能造血干细胞于骨内膜型壁龛的功能,而对多能造血干细胞自身复制并无直接作用。

成骨细胞也生成细胞因子。各种细胞因子组合参与造血干细胞的增殖分化调节,但游离型细胞因子挡不住造血干细胞分化。膜结合型细胞因子具有受体样分子结构。其细胞外结构域可结合其他细胞的表面受体,穿膜结构域把结合的细胞牢固地扣留在成骨细胞表面。细胞内结构域则可能传递信号,因此膜结合型细胞因子与其受体的结合可能引发双向信号传递,可见膜结合型细胞因子的作用不仅是调节造血干细胞迁移、归巢和定位,而且对造血干细胞及骨髓基质细胞的增殖分化都有直接作用。第一个被发现的具有骨髓造血调节功能的膜结合型细胞因子命名干细胞因子(stem cell factor,SCF),它是原癌基因c-kit编码蛋白的配体。实验研究结果证明,只含细胞外结构域的游离型SCF,通过结合造血干/祖细胞表面的c-kit刺激细胞增殖分化;而具有受体样分子结构的膜结合型SCF,则可刺激定位于骨内膜型壁龛中的多能造血干细胞以自身复制方式扩增。Fried等报道,缺失膜结合型SCF的小鼠骨髓造血功能很差,具有造血重建能力的多能造血干细胞明显减少。在20世纪80年代已有一系列实验研究结果,发现来自膜结合型SCF缺失小鼠的造血干细胞可以重建经辐射损坏的正常小鼠骨髓,而来自正常小鼠的造血干细胞不能拯救膜结合型SCF缺失小鼠的骨髓造血功能。输入游离型SCF也不能改善膜结合型SCF缺失小鼠的造血,只有同时植入正常小鼠的脾和骨髓细胞才有效。结果证明膜结合型SCF是骨内膜型壁龛中的重要生长因子,它直接调控定位于骨内膜中的多能造血干细胞的自身复制。由成骨细胞生成的另一个膜结合型细胞因子(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)主要调节造血干细胞的趋化运动,也能通过结合造血干细胞表面的SDF-1受体CXCR4而定位造血干细胞于壁龛,并引发信号传递。最近Nie等报道SDF-1/CXCR4信号可导致造血干细胞静止。

定位于骨内膜型壁龛中的造血干细胞,其生存状态和发育模式均受控于局部微环境。由成骨细胞及其分泌的细胞外基质和成骨细胞生成的细胞因子(特别是膜结合型细胞因子)共同构成的造血微环境才能调节造血干细胞的生存状态,使造血干细胞处于静止状态或自身复制。造血微环境中的各种成分对定位于壁龛中的造血干细胞都是外源性分子,它们与造血干细胞的表面受体相互作用。引发信号并传递到细胞核,再由一些转录因子对目标基因的表达进行调控、活化或抑制目标基因的表达,使细胞内基因表达重编程(gene reprogramming),从而改变细胞的生存状态。调节骨内膜型壁龛中多能造血干细胞自身复制或静止的信号通道主要有TGF-beta/ Smad、Jagged/Notch和Wet/beta-catenin。在保持造血干细胞的生存状态方面有重要作用。因此,信号传递通道相关分子是决定细胞命运的使者,也是阐明干细胞生存状态和发育模式不可或缺的研究内容。

经典的TGF-beta信号途径和非经典TGF-beta信号,平衡调节多能造血干细胞静止或进入细胞增殖周期而增殖分化。经典途径是TGF-beta结合并活化其受体后磷酸化smad2或smad3,导致它们与smad4聚合而转位于细胞核,smad4作为转录活化因子能招募转录辅助因子形成转录复合物,活化基因转录。smad6和smad7是这条信号通道的负性调节因子,通过竞争性结合smad4而阻止smad4入细胞核,从而抑制smad4的转录活化作用。近年发现核蛋白TIF-1 gamma(transcription intermediary factor 1 gamma)也能结合smad4,阻止smad4形成转录复合物而中断转录活化作用。TIF-1gamma在核内与smad4结合被认为是非经典的负性调节信号。在TGF-beta信号途径中,smad4是调节多能造血干细胞处于静止状态,或进入增殖周期的关键分子。Karlsson等用可控性表达载体携带smad4基因作转基因小鼠,适时地诱导造血干细胞中smad4缺失,发现smad4阴性造血干细胞具有正常的增殖分化能力,但重建造血的能力明显减弱,尤其用smad4阴性造血干细胞移植受者的骨髓第二次移植时,这些smad4阴性造血干细胞重建第二受者骨髓的能力比正常骨髓细胞低40倍。结果证明经典的TGF-beta信号通过smad4保存多能造血干细胞,否则终将因细胞的不断增殖分化而衰竭。Yamagaki等发现从骨内膜型壁龛部位分离的造血干细胞缺少成丛脂质筏(lipid raft clustering),并高表达周期素依赖的激酶抑制分子P57(kip2),使细胞处于静止的G0期,作者称之为冬眠状态造血干细胞。他们的实验研究结果,证明由成骨细胞生成的TGF-beta是骨内膜型壁龛中重要的诱导造血干细胞冬眠的信号分子,当TGF-beta结合造血干细胞表面的TGF-beta受体时,通过smad2和smad3磷酸化抑制AKT-FOXO信号途径调节的细胞膜脂质筏成丛,同时作为转录因子的FOXO在核中聚集,促进P57(kip2)高表达。作者指出来自TGF-beta的抑制性信号能储备多能造血干细胞于骨内膜型壁龛中。

据Duncan等报道,定位于骨内膜型壁龛的未分化多能造血干细胞高表达Notch1,其表达水平随细胞的分化程度递减。Notch的配体有Jagged和Delta。由成骨细胞生成的Jagged1是一种具有穿膜结构的分子,它结合造血干细胞表面的Notch1,不但能定位造血干细胞于骨内膜型壁龛,而且能引发双向信号,对造血干细胞的自身复制和成骨细胞的生长有双向调节作用。当Jagged1结合造血干细胞表面的Notch1分子时,活化的Notch1分子被Adam蛋白酶和r-secretase相继劈开,其细胞内结构域亚单位Notch1-1c转位入核,与转录因子RBP-JK(也称CBF-1)形成二聚体,并使RBP-JK从抑制状态变为转录活化状态,促进细胞增殖分化相关基因的转录。Duncan等用Notch转基因小鼠做实验研究,发现Notch的配体Jagged通过活化Notch信号途径使造血干细胞的骨髓重建能力增强。用r-secretase抑制剂阻断Notch信号时造血干细胞分化增加,具有骨髓重建能力的多能造血干细胞减少65%~80%。Calri等发现由Jagged1/Notch1相互作用的信号会转录活化Hes-1基因,促进造血干细胞自身复制,使骨髓中的LTC-IC数目增多,重建损伤骨髓的能力增强。Lahmar等发现表达膜结合型Delta4的基质细胞系,在体外与CD34+CD38low造血干细胞共孵育时能保存其干性,而分泌的可溶性Delta4则使CD34+ CD38low造血干细胞增殖分化,同时失去干性,显示LTC-IC数目减少。用r-secretase阻断Notch信号时,严重损伤膜结合型Delta对CD34+CD38low的干性保存作用,而对可溶性Delta的促增殖分化作用很少影响,表明膜结合型Delta4能引发经典的Notch信号,调节造血干细胞静止和自身复制。

影响造血干细胞在壁龛内发育的信号途径还有Wnt/beta-catenin。Wnt是高度保守的分泌型蛋白。目前已发现至少19种Wnt分子,它们通过结合细胞表面受体Frizzled(Fz)而引发经典的Wnt信号,使细胞内的beta-catenin从复合物中释放出来而转位入细胞核,在核内与TCF/LEF形成转录复合物,对其下游基因进行转录表达调控。造血细胞也表达Frizzled受体,作为Wnt分子受体的Frizzled与Wnt3a相互作用时引发经典的Wnt/beta-catenin信号,最终转录活化Notch和HoxB4,促进造血干细胞自身复制。造血干细胞也表达Wnt5a,它也可能通过自分泌调节机制促进造血干细胞自身复制。但造血干细胞在体外培养中,可溶性Wnt5a和Wnt3a对细胞增殖显示拮抗作用,这种矛盾现象可能产生于多种信号途径的交叉对话。Jagged1/Notch信号对造血干细胞的自身复制虽然很重要,但缺失Jagged1 或Notch分子的小鼠骨髓细胞仍具有修复损伤骨髓的能力,这种矛盾现象也是由于多种信号途径的交叉互补作用。多种实验结果表明,造血微环境中的外源性分子对造血干细胞命运的调节十分复杂,还有很大的研究空间去阐明其调节机制。

(宋增璇)

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