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体外扩增的只能是造血祖细胞而不是造血干细胞

正常造血干细胞在体外也同样地进行不对称性有丝分裂,它的数量不可能增加。所谓“干细胞扩增”实际上只能是“祖细胞扩增”。因此,至今国际上还没有人真正制备出即使能够短期保存的正常造血干细胞的克隆或细胞株。

在胚胎造血早期以及造血严重损伤的应激期,部分造血干细胞可能进行一时性的对称性有丝分裂,以适应胎儿扩大造血的需要;当体内造血干细胞达到正常的数量和质量时,它们又恢复不对称性有丝分裂,才能保持正常的自我更新和自我维持能力。这种应激能力是干细胞的基因所决定的。在造血干细胞过度增殖中,容易发生不可逆的多基因突变,使干细胞无法恢复它应有的不对称性有丝分裂,而成为分化凋亡受阻、无限扩增的恶性细胞。在重度辐射损伤恢复的远期效应中,白血病、淋巴瘤是最多见的。成人肝细胞也是静止的。一旦因感染或其他原因使肝细胞大量坏死,诱发活存的肝细胞进行高度代偿性增殖,而引起细胞多基因突变,使远期的肝癌发生率明显升高。正常造血系统祖细胞扩增的潜力很大,而且边增殖边分化/凋亡,有效地防止细胞的恶变。正常造血干细胞只有少数处于细胞周期中,进行不对称性有丝分裂。当经过若干次有丝分裂后,细胞便停止进入S期,而转入静止期G0。正常干细胞保持在G1和G0期之间转换,使细胞在连续分裂过程中可能发生的基因突变得到修复。凡突变不能修复的细胞,在p53基因调控下走向凋亡,它有效地防止正常干细胞在连续多次分裂后的恶性变。

如果在体外设法诱导突变或用外源基因导入等技术,使干细胞实行对称性有丝分裂,无限扩增而不分化,即成为克隆化的细胞;或在体外设法使干细胞大量从G0期转入G1期,以达到干细胞扩增的目的,即所谓“强迫扩增”(forced expansion),其结果必然是干细胞的恶性变,丧失正常干细胞的自我更新和自我维持能力,丧失干细胞分化能力,也不可能重建正常造血。这样的细胞对临床移植毫无价值。

如果在脐带血CD34+细胞培养中,加入的细胞因子不适当,或培养时间过长,既促增殖又促分化,使干细胞的不对称性有丝分裂遭破坏,丧失了自我更新力,每次分裂后的两个子细胞全都分化为祖细胞。培养时间过长,连早期祖细胞(LTC-IC,CFUGEMM,培养21天的pBFU-E)也分化耗尽。虽然得到大量CD34+细胞或有核细胞,却都是毫无重建造血功能的晚期造血祖细胞(CFU-GM,CFU-E,短期培养的mBFU-E),说明扩增的失败。

研究脐带血细胞体外扩增的最理想也是有望实现的目标应是早期祖细胞大量增加,同时务必基本保持干细胞数量和质量。怎样如何实现这个目标,正是国际上许多实验室奋力研究的。目前,许多报告表明人的CD34+细胞如果经体外扩增后大量地增加,但还没有能证实扩增后的移植物能在人体内长期重建造血。现在许多实验室在CD34+细胞大量扩增后,干细胞已显著减少或消失,但只要还含有丰富的早期祖细胞,仍然可用做祖细胞的移植,达到短期重建造血的治疗目的。仍适用于实体瘤化/放疗和急性辐射损伤的治疗。如果扩增后连早期的祖细胞也分化耗尽,只剩下晚期的祖细胞和成熟细胞,才是扩增的失败。

在正常人体内,晚期祖细胞CFU-GM的检测结果常常反映体内造血干细胞和早期祖细胞的水平。但在体外培养中就完全不同了。当晚期祖细胞(CFU-GM,mBFU-E等)在CD34+细胞体外培养中大量增加时,应该警惕可能早期祖细胞正同时大量分化而耗尽。这时,做早期祖细胞的检测便可作出判断。总之,千万不可看到培养后细胞总数和CFUGM的大量增加而盲目乐观。如果CFU-GM和mBFU-E等晚期祖细胞大量增加而早期祖细胞却减少甚至分化耗尽,恰恰是扩增的失败。

在进行造血祖细胞培养扩增时,如果实验室没有条件直接做最早期祖细胞CFU-HPP或LTC-IC检测,也不能做CD34+CD33-DR-或CD34+Lin-等多参数表面标志检测,不妨检测CFU-GEMM,或培养21天的pBFU-E,BFU-MK也很有参考价值。如果上述条件也不具备,那么做CD34+细胞计数的同时,又根据晚期祖细胞CFU-GM、mBFU-E检测结果,用排除法来推测早期祖细胞的数量变化。总之,体外扩增时最应关注的是早期祖细胞的扩增。有的学者在扩增时加入抗TGF-beta抗体,企图阻止早期祖细胞的分化,使扩增成功。体外培养干细胞、扩增祖细胞时,必须在培养液中加入细胞因子。各个实验室用的细胞因子有所不同。其中SCF、FL(FL3 ligand)和TPO都是各家必用的。有些细胞因子不仅刺激增殖,也同时促进分化,如IL-3,则不宜使用。

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