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用人类造血干细胞做基因载体的研究为何屡遭失败

用人造血干细胞做基因转染,首先遇到的困难是基因转染率太低。考虑到正常干细胞数量太少,而病毒颗粒在体外生物半衰期很短(6~8小时),其布朗运动极慢(600μm/h)。因此,病毒颗粒在培养液中与靶细胞相遇的几率很低。于是许多人热衷于体外扩增干细胞,但至今未有成功的报告。其原因有三:

一、干细胞的基本特征是自我维持和自我更新。即干细胞通过它不对称性的有丝分裂,在不断产生祖细胞的同时,使自己不增殖也不分化。所以,正常干细胞的特征便是在体内外保持自己的数量不变,质量也不变的条件下不断地生成大量祖细胞。最近国外学者报告在体外培养中,证实了干细胞的上述特征。证明正常造血干细胞是不能扩增的。CD34+细胞群体良性生长的比例结构应该是尖向上的正向三角形,即越是早期的细胞越少。干细胞是CD34+细胞群体最小的一部分。CD34+/CD38-/Lin-为干细胞,CD34+/CD38+/Lin+为祖细胞。不可把CD34+细胞笼统地称为干细胞。有人希望正常干细胞在培养中既大量增殖,又不分化。这实际上意味着细胞的恶性生长。

二、缺乏一种模拟体内造血微环境的培养体系。在体外培养CD34+细胞时,加入的细胞因子,有的既能促进细胞增殖,又能促进细胞分化,如白介素3等。这些细胞因子加在CD34+细胞的培养液中,使祖细胞大量扩增,同时也促进干细胞的分化。当祖细胞扩增数量达到最高峰时,也可能是干细胞分化耗尽之际。干细胞在体内微环境下的有丝分裂中,其中一个子细胞保持不分化。但在体外培养中,干细胞却失去这种自我维持能力,不久就分化到终极而凋亡。

三、迄今为止,造血干细胞还没有一个体外培养集落检测的方法。CFU-HPP、LTC-IC等也是最早期的髓系造血祖细胞,它们和干细胞移植后的造血永久重建无相关性。许多临床细胞移植的病例报告表明,经体外扩增后的移植物中虽然含有大量LTC-IC 或CFU-HPP,但移植后患者体内的外源性造血重建都仅仅维持不足6个月。国内外不少进行CD34+体外细胞扩增的研究,只看CD34+细胞的计数和造血祖细胞集落观察指标,却都缺乏检测干细胞的手段。用流式细胞术多参数细胞表型的分析,如观察扩增前后CD34+/CD38-/Lin-(/Thy1+)细胞群体的比值变化;或者用人胚胎骨(human fetal bone)-SCID方法,在SCID或NOD-SCID小鼠皮下先埋植人胚胎骨,再在骨髓腔中,植入人CD34+细胞。数周后取出细胞作为移植物,注入另一个SCID鼠皮下的人胎骨腔中;同时,再注入另一个SCID鼠皮下埋植的人胎胸腺中。观察植入的细胞样品生成髓系和淋巴系祖细胞的表型鉴定(注意:造血干细胞多向分化的新定义是既向髓系分化,又可向淋巴系分化。髓系祖细胞分化也是多向的,包括红、粒、单核巨噬、巨核等,但没有淋巴系)。以上两个方法,都可以较准确地判断在扩增过程前后干细胞数量变化。可惜目前国内一般实验室都无力用上述的方法检测干细胞。但是前一种方法,即流式细胞术的多参数分析技术(3个参数CD34+/CD38-/Lin-比2个参数CD34+/ CD38-更好)在我国很多城市是可以做到的。扩增前后相比,干细胞是否减少,至少要看CD34+/ CD38-/Lin-(/Thy1+)细胞群的定量分析的结果。

近年来,经动员的外周血干细胞的富集技术日趋完善。动员的外周血CD34+细胞移植物中含足够数量的干细胞(>108),做干细胞基因转染就无需先体外扩增。而且,用G-CSF动员的外周血CD34+/ CD38-细胞很多从G0期转移到G1期。这也有利于提高反转录病毒载体与目的基因整合到干细胞的基因组中,因为仅仅在有丝分裂的阶段,反转录病毒载体的反转录DNA才能整合到染色体的基因组中去。

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