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基因治疗中如何人为地调控在体内的基因表达水平

当基因治疗某些疾病时,要求目的基因能在体内永恒表达发挥治疗作用的疾病,如糖尿病、高血压、帕金森病、先天性单基因缺损的各种疾病等,其目的基因的理想宿主细胞自然是永不消亡的造血干细胞。但如果不是为了弥补基因缺陷,而是为了在一个短时间内达到某一治疗的目的,仅要求目的基因在患者体内短期表达。如为了实现对肿瘤的超大剂量化疗时保护造血细胞用的多药耐药基因的转染,则目的基因MDR-1转染的宿主细胞不应是干细胞,而是早期祖细胞。对化疗、放疗敏感的是祖细胞,而不是干细胞。大多数造血干细胞是处于静止期的,对化疗/放疗都不敏感。全部处于细胞增殖周期中,因而对化疗药物及放射线很敏感的祖细胞倒是需要保护。总之,MDR-1基因转染的靶细胞自然应该是早期祖细胞。这是目前许多从事这方面研究的同道们认识上存在着的一个的误区。

为什么成功地用于小鼠造血干细胞的基因转染技术,却不适用于人呢?人们发现,反转录病毒颗粒进入靶细胞,首先必须是病毒颗粒的外壳(envelop)糖蛋白gp70和靶细胞表面某种蛋白发生专一性的结合。靶细胞表面的专一性结合某种病毒的蛋白,称为病毒受体。用于小鼠的亲嗜性反转录病毒载体(ecotropic retroviral vector)只能用于小鼠而不能用于人。小鼠造血干细胞表面有较丰富的亲嗜性反转录病毒受体,而人的造血干细胞表面没有亲嗜性反转录病毒受体,仅有少量的双嗜性反转录病毒受体(amphotropic retrovirus receptor),即PiT- 2受体。所以,适用于人造血干细胞做基因转染的,是重组的双嗜性反转录病毒载体(amphotropic retroviral vector)。于是,科学家们近年来致力于如何增加人干细胞表达专一性的PiT- 2受体,以增加基因的转染率。美国NIH国家人类基因组研究中心Bodine等,用乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)32μmol/L或IL- 1α 10ng/ml加入培养24~48小时,可以使人的CD34+/CD38-/Lin-细胞表面的PiT- 2受体明显增加,从而提高了双嗜性反转录病毒载体的基因转染率。他们还发现:HL-60细胞原本缺乏PiT- 2受体,所以是抗双嗜性反转录病毒转染的。但他们用PMA使HL-60细胞表面的PiT- 2受体增加,就能使反转录病毒载体基因转染到HL-60细胞中,而且转染率很高。其基因转染率和HL-60细胞的PiT- 2 mRNA水平呈正相关,却和HL-60细胞处于什么周期状态无关。这些研究结果引发了广泛的兴趣。它关系到当干细胞PiT- 2受体增加时,是否即使干细胞处于G0期静止状态,也能提高其反转录病毒载体基因转染率?

NIH实验室又报告,干细胞经低温冷冻后,可以增加细胞表面的PiT- 2受体数量。还有许多实验室探索如何提高人造血干细胞的基因转染率。如在体外培养中,把人CD34+细胞平铺在贴壁的骨髓基质细胞上,再加入粘连蛋白(fibronectin)和病毒上清,即可有效地提高其基因转染率。至于,CD34+细胞与包装细胞共沉淀时用的高速离心或加入磷酸钙和其他一些化学试剂等,以及上述用的低温冷冻等技术,即使目的基因ex vivo转染率可以明显提高,但如果这些操作要影响干细胞的体内植活力和重建造血的活性,那也是不可取的。这应当引起注意。

干细胞移植成功究竟至少需要多少干细胞植入骨髓?造血干细胞临床移植时,有的学者从理论上估计有几千或甚至几百个干细胞植入骨髓就够了。也就是说,造血干细胞的基因转染率是否一定需要很高?如果设法把带有目的基因的CD34+细胞直接输入骨髓腔,则即使细胞的基因转染率低,是否也照样可以达到基因治疗的目的呢?临床造血干细胞移植也无人做过这样的探索。

随着人类基因组研究和造血干细胞生物学的发展,将可能找出干细胞调控分化的基因,干细胞分化调控机制和自我维持自我更新的调控机制得到充分阐明。到那时,白血病细胞分化受阻的机制也得到答案,其根治办法也可能是基因治疗。目前还很难想象,在那时正常人的造血干细胞能否在体外扩增,进行克隆,而不发生恶变?能不能在体外有效地制备出正常人类造血干细胞的细胞株?果真如此的话,造血干细胞的移植和基因治疗在技术上将毫无困难了。

人类造血干细胞基因治疗实际上是基因治疗技术和造血干细胞移植技术的融合和发展。也是学科交叉的产物。它不但促进干细胞生物学的发展,使基因治疗开辟了新的领域,而且将扩大造血干细胞移植的适应证范围,而且将使整个血液学发展到一个新的纪元。

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