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集落刺激因子类

集落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)是一大类研究最早的细胞因子。20世纪60年代初在建立造血祖细胞体外软琼脂培养方法时发现,有些组织提取物和体液中存在能刺激粒-巨噬细胞生长形成集落的因子,命名为粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);能刺激粒细胞生长形成集落的因子,命名为粒细胞集落刺激因子(G-CSF);刺激巨噬细胞生长形成集落的因子,称为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。实际上红细胞生成素(EPO)应称为红细胞集落刺激因子,因为在20世纪50年代就已发现EPO的存在,文献上沿用已久而保留原名;刺激血小板生成的细胞因子推测与TPO性质类似,虽然到20世纪90年代初才克隆,也随之称为血小板生成素(TPO)。沿用这些名词纯属习惯。

红细胞生成素

红细胞生成素(EPO)基因位于7号染色体长臂,蛋白由165个氨基酸残基组成,分子量18kD,糖基化后34~39kD,是糖蛋白激素。胚胎期主要由肝细胞生成,在成人主要由肾脏合成,肝脏产量仅占1/9。EPO是红系造血调控的核心因子,它防止红系各阶段细胞的凋亡。SF和IGF-1也起重要作用。涉及红细胞生成的细胞因子还有IL-3、IL-9、IL-11、TPO和GM-CSF,它们参与诱导红系前体细胞的启动和增殖,可能还有别的因子如血管紧张素(angiotensinⅡ)也与红系造血有关。其中个别因子能在没有EPO存在下诱导红系细胞增殖。

有众多的生长因子调节红系造血前体细胞(BFU-E),但是只有二种生长因子(EPO和IGF-1)对于大多数红系各阶段的细胞增殖和分化是必需的。就整体而言SF和EPO对红系造血是必不可少的,缺乏它们就会导致贫血。

成体的EPO主要来自肾脏,肝脏也产生一些,有些肝癌细胞系可表达EPO。缺氧可诱导EPO的表达。EPO的受体(EPOR)基因位于19号染色体,编码的蛋白属Ⅰ类受体。受体后信号传递通过JAK/STAT途径,酪氨酸激酶磷酸化位点在SH2结构域,并通过STAT2,STAT5,蛋白酪氨酸磷酸化酶SHPTP1和SHPTP2,以及PI3激酶和SHP1。别的传导途径可能有蛋白激酶C成员。

EPO对红系造血前体细胞的作用与SCF协同;对后期红系造血细胞的作用与IGF-1协同。

作为最早确立的造血生长因子EPO也是最早应用于临床的细胞因子,对于肾性贫血的疗效是肯定的,已经作为药物广泛使用。近年的研究进展表明除红细胞外其他细胞也可以表达EPO受体,发现了EPO的许多非造血效应,如不仅胎肝红系造血需要EPO,胎儿血管生成和脑发育也需要;创伤愈合、脑和心脏损伤及血管新生都有内源性的EPO-EPOR信号传递参与,许多研究者正在探索扩大其应用范围。临床试验表明重组EPO可用于肿瘤患者治疗肿瘤相关的贫血,减少输血量,改善生活质量,延长生存期。但是有报道有些肿瘤用rEPO后加速肿瘤进展,研究表明这些肿瘤细胞有EPO受体表达,治疗用rEPO起旁分泌作用刺激肿瘤细胞增殖,抑制凋亡,影响对化疗药物的敏感性。rEPO用于肿瘤患者的治疗作为专题正在继续研究中。研究资料表明除了造血系统外EPO对于其他组织中有EPO受体的细胞(如内皮细胞、神经细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞)有抗缺血作用。观察表明EPO在心肌缺血时通过减少缺血面积,促进血管新生保护心肌;在中枢神经系统缺血时有保护神经原作用。可能在其他组织缺血时也起保护作用,EPO及其新研制的衍生物作为组织保护剂正在神经和心血管疾病中深入研究。

血小板生成素(TPO)

血小板生成素是332个氨基酸残基(95kD)组成的糖蛋白,有两个结构域:与红细胞生成素同源的受体结合结构域(残基1~153)和高度糖基化富含碳水化合物保持蛋白稳定的结构域(残基154~332)。TPO蛋白有4个螺旋折叠,与受体1:2化学计量结合,结合常数为3. 33×10-9mol/L和1. 1×10-6 mol/L。

TPO受体c-Mpl是典型的造血细胞因子受体,有两个细胞因子受体同源模块(CRM),TPO只结合末梢的CRM1并启动信号转导。

血小板生成素在肝脏合成,没有贮存形式即分泌于外周血循环中,尚不知其他组织能否产生TPO。造血干祖细胞、巨核系列细胞均表达TPO受体。TPO在结合巨核细胞的TPO受体后启动的信号转导途径有:JAK2和STAT5磷酸化导致细胞增殖;MAPK活化导致细胞分化;激活抗凋亡途径增强细胞活性。虽然TPO能促进多潜能干细胞和所有系列祖细胞的活性,其主要效应在于刺激巨核细胞系列的集落形成细胞的生长和活性,增加成熟巨核细胞和血小板的生成。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)

G-CSF现在有些文献上又称CSF-3,是系列特异性较强的集落刺激因子,主要调节中性粒细胞的增殖、分化和功能。已在临床广泛应用于升高中性粒细胞。人类G-CSF的基因定位于17号染色体(17q11-q23)。由于第二个内含子的5'端拼接部位的序列变异,可形成二种mRNA,还有三个糖基化位点,所以天然的G-CSF并非均一。人类G-CSF的受体仅在中性粒细胞上测出,100~300位点/细胞,100 ~300pmol/L,所以G-CSF的系列特异性较强。

粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)是由813个氨基酸残基构成的跨膜蛋白,包括188个氨基酸残基构成的胞内区。胞内区分为两部分:proximal-Box1、Box和distal Box3。Box1和Box2主要传递增殖信号,有3个酪氨酸残基(Y704,Y729,Y744);Box3传递分化信号,有1个酪氨酸残基(Y764)。GCSFR的胞内区没有酪氨酸激酶活性,但是能激活细胞内酪氨酸激酶的活性。在G-CSFR与粒细胞集落刺激因子结合后,受体寡聚化,4个酪氨酸残基迅速磷酸化启动信号传递。例如Y704和Y744,可能有时还有Y729激活STAT3。SHP2/Grb2复合体结合于Y704和Y764。同时Y764对于Shc/Grb2/ p140,Grb2/p90复合体的形成和p21的激活是必需的。Jak2和(或)其他Jak激酶结合在Box1和Box2之间的部位色氨酸650(W650)。Jak2激活包括Stat1、Stat5和c-Rel在内的其他蛋白。G-CSF受体后的信号传递还包括src激酶Lyn和Syk激酶等。

巨噬细胞集落刺激因子及其受体

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)又称集落刺激因子-1(CSF-1),由于它能促进和维持单核-巨噬细胞的增殖和分化而得名。M-CSF受体属酪氨酸蛋白激酶受体第Ⅲ亚族,由原癌基因c-fms编码。M-CSF受体与配体结合引发的细胞内级联反应包括:蛋白激酶活化,蛋白质磷酸化,离子通道通透性改变,磷脂酶激活以及生物大分子合成增加。M-CSF还与多种非造血组织和器官的生长发育,以及非造血系统疾病有关,包括妊娠、胚胎发育、骨骼形成、妇科肿瘤、动脉粥样硬化斑块形成、慢性肾衰竭、男性不育、前列腺癌、某些炎性疾病以及一些中枢神经系统疾病。在一些病理情况下,尤其在某些恶性组织中往往存在M-CSF和M-CSFR的共表达,以自分泌或旁分泌机制传递信息,提示这一对信号分子在肿瘤相关疾病中有重要意义。

人类M-CSF的基因位于染色体1p21(早期文献报道在5q33. 1)。M-CSF由单基因编码,基因全长21kb,有10个外显子。由于转录过程中第6号外显子的选择性剪接,产生16kb、40kb和20kb的M-CSF mRNA分子,分别合成由256、545和438个氨基酸残基组成的蛋白产物,依次命名为M-CSFα,M-CSFβ 和M-CSFγ。其中前者加工成44kD的成熟蛋白质,后两种形成90kD的二聚体,三种M-CSF具有相同的由149个氨基酸残基组成的N末端和75个氨基酸组成的C末端。人和小鼠M-CSF的DNA序列存在70%同源性。按存在形式,M-CSF分为可溶型(分泌型),膜结合型(mM-CSF)和细胞外基质结合型M-CSF(PG-M-CSF)。产生M-CSF的细胞很多,生理条件下,激活的单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、骨髓基质细胞、胎盘滋养层细胞、星形胶质细胞、成骨细胞及某些间质细胞可分泌不同水平的M-CSF。正常血清和尿液中M-CSF含量约100~800U/ml。在某些病理组织或细胞中,M-CSF及其受体表达异常升高。包括乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、髓系白血病细胞、动脉粥样硬化斑块、慢性肾衰竭和慢性肾小球肾炎患者的肾小球内膜细胞、神经胶质瘤细胞、AIDS病毒感染的单核巨噬细胞及有些炎症细胞等。

M-CSF在体内的降解是通过M-CSFR介导的细胞内在化过程完成的。与M-CSFR特异性结合后,M-CSF/M-CSFR复合物很快内在化,形成由包涵体包裹的微粒体与溶酶体融合,M-CSF和M-CSFR一起降解。肝和脾是血清M-CSF的主要清除器官,其中肝脏库普弗细胞通过其表面特异性受体将多数M-CSF分解。肾脏亦参与M-CSF的分解代谢,将其代谢产物排出体外。

M-CSF受体的结构特点:人M-CSFR基因(cfms)位于第5号染色体5q33. 3-33. 4,全长399kb。猫v-fms产物和人c-fms的产物虽具有较高的同源性,但它们具有不同的C末端,且存在一些点突变。M-CSFR是由927个氨基酸组成的跨膜蛋白,包括一个含有信号肽(19个氨基酸)的512个氨基酸组成的胞外结构域(配体结合部位),一个25个氨基酸组成的跨膜区以及一个由435个氨基酸组成的酪氨酸激酶结构域,分子量150kD。M-CSFR胞外区含有5个免疫球蛋白样结构域D1~D5,分子内形成稳定的二硫键,共有11个糖基化位点,形成分子量为150kD的跨膜糖蛋白。胞内激酶区被一段亲水氨基酸序列分隔为3部分:激酶区、激酶插入区和激酶区2。激酶插入区对M-CSFR生物学功能必不可少,剔除此区导致受体介导的PI3激酶通路阻断,但仍可使细胞增殖。深入研究发现,激酶插入区内Tyr721 是PI3激酶保守序列所必需。在激酶区紧靠膜部分有一富含甘氨酸序列(GXGXXG),是典型的激酶区域。现已确定人M-CSFR分子中多个磷酸化位点为M-CSFR发挥生物功能所必需,包括Tyr543、Tyr696、Tyr705、Tyr720、Tyr807及Tyr921。最近研究表明MCSF在巨噬细胞由G1期跨入S期过程中起决定性作用,M-CSFR酪氨酸激酶的活化又是胞内c-fos、cjun、c-myc和周期蛋白D表达所必需。

M-CSFR存在可溶性形式(sM-CSFR)。可溶性受体通过膜结合型受体水解产生。生理条件下,产生sM-CSFR的数量受严格控制。血清中sM-CSFR具有中和、下调配体的作用。作者实验室用免疫沉淀及免疫印迹实验发现在正常人血清和尿液中存在sM-CSFR。急性白血病、MDS、再障患者低于正常人;ITP患者高于正常人;CML及IDA与正常人无显著差别;初步检测肝、肾疾病和实体瘤患者的血清sM-CSFR水平也有明显不正常者。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及其受体

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)又称CSF-2,是早期发现的多功能造血生长因子,由于能使骨髓的造血前体细胞形成粒细胞和巨噬细胞集落而得名。GM-CSF是分泌型的单链糖蛋白,其受体由α链和β链异二聚体构成。α链特异性结合配体,β链与IL-3及IL-5受体共有,起信号传导作用。已知GM-CSF受体激活至少能刺激三个信号传导通道:JAK-STAT通路;MAPK通路和PI3K通路。GMCSF和IL-3在造血调节功能方面的交叉是由于它们的受体有共同的受体β亚单位,有类似的信号转导功能。

除了造血前体细胞外,GM-CSF对单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞都有明显的体外作用,增强它们的生存、增殖、分化能力和活性。还用于体外扩增树突细胞。单核细胞和巨噬细胞是GM-CSF和M-CSF的共同靶细胞,虽然它们的作用有许多共性,但也有明显的不同点。其他系列的细胞(如角质细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞)若表达GM-CSF和M-CSF受体也能对这些细胞因子起反应。

M-CSF在血液中有稳定的表达水平,体外培养的多种细胞能组成性表达M-CSF,包括成纤维细胞、内皮细胞、基质细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和成骨细胞;而GM-CSF的产生通常都要有刺激如感染,体外培养则需加IL-1、TNF或脂多糖。GM-CSF和MCSF在炎症和自身免疫状态下呈高水平表达,如类风湿关节炎患者的关节滑液。

GM-CSF刺激造血祖细胞向单核细胞和粒细胞分化,可以减少肿瘤患者由于粒细胞减少症引起的感染;GM-CSF也能诱导髓系树突细胞分化,促进Th1细胞免疫反应,可能增强抗细胞免疫反应。近年来由于在酵母表达系统生产的重组人GM-CSF (sargramostim,沙格司亭)的问世,GM-CSF的临床应用从减少粒细胞减少症,减少感染,刺激单核细胞/树突细胞生长向增加细胞免疫,间接增强抗肿瘤免疫和增强肿瘤的免疫原性以及增强肿瘤细胞对化疗的敏感性,增加缓解率方向发展。已有的临床试验结果表明:用集落刺激因子治疗儿童肿瘤的发热性粒细胞减少症,约20%有效。体外试验表明rhGMCSF加上其他细胞因子(TNF-α或IFN-α)能增加肿瘤细胞的抗原递呈量;临床试验结果仅少数病例有效,而且作用不持久。已在多种肿瘤发现GM-CSF刺激自身免疫反应,包括肾癌、前列腺癌、黑色素瘤和淋巴瘤,GM-CSF能刺激自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞,上调Fc-γ和补体受体,已经用于研制各种类型的抗肿瘤疫苗。将GM-CSF用于肿瘤患者的前提是患者必须有免疫反应,临床试验结果往往是患者的免疫反应不够强,而且反应不持久,仅在少数患者有持久的反应。

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