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作用于早期造血细胞的细胞因子:Kit配体、Flt3配体

本文介绍的作用于早期造血细胞的细胞因子,主要是Kit配体(KL)和Flt3配体(FL)。

c-kit,flt3和c-fms受体基因在外显子大小、数目、序列和外显子/内含子界限位置等方面十分相似,提示它们可能是从同一基因进化而来的。由于它们的相似性,近年来的研究往往将它们进行对比以便揭示它们的内在规律。Kit配体(KL)和Fit配体(FL)是研究最多的主要调节早期造血细胞的造血调控因子。它们的发现过程与集落刺激因子的发现截然不同,这两个因子都是先知受体后找到配体的细胞因子,均以受体的配体命名。这两个受体都属酪氨酸激酶受体族,与M-CSF受体同属于一个亚族。都是由约1000个氨基酸残基组成的一次跨膜糖蛋白,都有经配体激活后有酪氨酸激酶活性的胞内区,和五个免疫球蛋白样结构域的胞外区组成。目前已知该亚族有五个成员:c-fms(M-CSF受体)、血小板衍生的生长因子(PDGF)受体α和β、c-kit 和flt3。

c-kit配体的发现较早,过程复杂,渊源于对小鼠5号染色体w位点的深入研究:早在20世纪初就知道腹部有白色斑点(white spotting)的小鼠有遗传缺陷,生殖细胞和造血功能有缺陷,易患巨幼细胞贫血。经数十年研究找出二十多个W位点的等位基因变种,其中有一个变种位于10号染色体名为Steel (Sl)。1988年证实W位点编码的蛋白即c-kit的蛋白产物。1990年三个实验室同时报道发现了c-kit配体,认为是干细胞因子(stem cell factor,SCF),立即引起实验血液学界广泛关注。由于复杂的研究背景c-kit配体的别名很多,如Sl因子、SCF、肥大细胞生长因子等,随着研究的深入,对它的作用有了较确切的评价,可能叫它c-kit配体(KL)合适。

c-kit配体的发现为细胞因子的研究开辟了新途径,掀起了寻找孤儿受体配体的热潮,由此发现了mpl配体即血小板生成素TPO;稍后发现了Flt3配体(FL)。不过FL发现的方法有所不同:有一组作者用非严谨杂交法,以c-fms DNA为探针从cDNA文库钓出相关序列,称为fms样酪氨酸激酶3(fms like tyrosine kinase 3,flt3);另一组作者用变性的酪氨酸激酶结构域的寡核苷酸用PCR法由小鼠胎肝细胞分离出,称胎肝激酶2(fetal liver kinase 2,flk2)。这两组作者所得的受体胞外区结构域仅两个氨基酸不同;胞内区尤其是C末端差别较大。配体的获得有两种方法:用可溶性受体筛选细胞系,表面有阳性反应者用RT-PCR法取得其cDNA;或用flt3胞外区蛋白制备的亲和层析柱,在细胞系条件培养液中筛选配体蛋白,作末端氨基酸序列分析,再用PCR法取得cDNA。人类的相应受体是用flt3筛选出的,所以称为Flt3配体(FL)。

c-kit受体基因包括21个外显子,基因组有70kb。人类flt3基因组约100kb,含24个外显子。人类FL基因组约50kb,与M-CSF类似也含8个外显子。FL、KL和M-CSF外显子大小和结构的相似性提示它们在进化上的同源性。人类flt3基因组的染色体定位在13q12;c-kit在4q11. 34;FL在19q13. 3-13. 4;KL在12q14. 3。对于c-kit和KL的遗传变异已研究得很透彻,在分子水平得到阐明,主要是点突变,尤其是c-kit的胞内区点突变可导致酪氨酸激酶活性降低。有些变异则导致c-kit的表达下降。对于flt3和FL的遗传变异则尚无报道。髓系恶性疾病往往与19号染色体的三倍体化相关,FL基因在19q13. 3-13. 4,19号染色体三倍体化与FL基因变化有无关系,以及与髓系恶性疾病的相关性有待研究。

FL的结合和生物学活性均无种属特异性。小鼠和人类的FL蛋白均能与细胞表面的小鼠或人类的Flt3受体充分结合。人类的FL蛋白可刺激小鼠、猫、兔、非人灵长类和人类的细胞产生生物学效应。反之,KL则有种属特异性,小鼠的KL对人类的细胞有作用,人类的KL只对人类的细胞起作用。

c-kit和Flt3受体的结构与M-CSF受体的结构相似,胞外区均有五个免疫球蛋白样结构域。c-kit 和M-CSF受体的胞外区前三个免疫球蛋白样结构域为结合配体所必需的结构,第四个免疫球蛋白样结构域与受体二聚化相关。Flt3受体的结构与功能的关系尚无报道。小鼠及人类的c-kit蛋白均由976个氨基酸残基构成,胞外区有9个N糖基化位点。肽链分子量108kD糖蛋白有两类:140kD和155kD。不同组织来源的c-kit大小不同。小鼠的Flt3受体由1000个氨基酸残基构成,人类的Flt3受体由993个氨基酸残基构成,胞外区各有9个和10个N糖基化位点,肽链分子量约110kD,糖蛋白也有两类:130~143kD和155~160kD。

c-kit与KL的结合有高亲和力(Kd:16~310pmol/L)和低亲和力(Kd:11~65nmol/L)两类。Flt3受体和FL的结合仅有人类的髓细胞白血病的高亲和力(Kd:200~500pmol/L)报道。小鼠和人类的c-kit cDNA克隆表明有两类异构体,由于选择性剪接在跨膜区的上游四个氨基酸(甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-赖氨酸,GNNK)有或无,GNNK缺失的c-kit可出现没有配体结合的构成性磷酸化。在人类的急性髓细胞白血病细胞和白血病细胞系GNNK-和GNNK+的比例为15:1和10:1。此外c-kit的胞内区还可有715位丝氨酸插入,在细胞系和新鲜白血病细胞均可测出。c-kit的可溶性受体已在白血病细胞系的培养液和人血清(324ng/ml±105ng/ ml)测出,产生机制不明,但是肯定能与KL结合。上述c-kit异型体的生理意义有待研究。

KL和FL的蛋白结构与M-CSF都很相似。小鼠和人类的KL蛋白均由273个氨基酸残基构成,N端在胞外,25个氨基酸残基构成引导肽,185个氨基酸残基构成胞外区,27个氨基酸残基构成跨膜区,还有36个氨基酸残基构成的胞内区尾端。小鼠的FL蛋白有4个N糖基化位点;人类的FL蛋白有5 个N糖基化位点。中国仓鼠和Buffalo大鼠的FL蛋白有O糖基化位点。KL、FL、M-CSF都有保守的4个半胱氨酸残基。KL蛋白形成两个分子内二硫键,FL和M-CSF形成三个分子内二硫键。M-CSF还有一个未配对的半胱氨酸残基能形成分子间二硫键。这些差异使KL、FL、M-CSF的空间结构不同,因而生物学活性不同。小鼠和人类KL蛋白的突变研究表明,含有保守的4个半胱氨酸残基的胞外区结构域是活性中心,其他区域对生物学活性均无影响。小鼠和人类的FL蛋白分别由231和235个氨基酸残基构成,前27(小鼠)和26(人类)个氨基酸残基构成信号肽,紧接的161(小鼠)和156(人类)个氨基酸残基构成胞外区,22(小鼠)和23(人类)个氨基酸残基构成跨膜区,21(小鼠)和30(人类)个氨基酸残基构成胞内区尾端。小鼠和人类的FL胞内区只有52%的同源性,胞外区有92%的同源性。小鼠和人类的FL胞内区各含两个N糖基化位点。FL、KL均为带有短的胞内区跨膜蛋白,有4个螺旋结构。小鼠和人类的成熟KL蛋白是经蛋白酶分解后的164个氨基酸残基构成的可溶性蛋白,有生物学活性。第一个蛋白酶解位点由第6外显子编码,第二个蛋白酶解位点由第7外显子编码,正好位于跨膜区上游。第二蛋白酶解位点仅在第一蛋白酶解位点缺失时启用。小鼠和人类的KL和M-CSF类似都有第6外显子的选择性剪接。可溶性和膜结合型KL都是正常发育所必需的,不同组织产生不同的异型体。

用PCR和多种cDNA分析已确定FL也有多种异型体,细胞表面的跨膜型FL起主要作用,其跨膜区酶解产物则是有活性的可溶性FL。小鼠的FL是膜结合型的,但不是跨膜型的,因为剪接时丢失的内含子引起读码框的变化,失去了酶切位点。人类的FL无此类异型体。小鼠和人类的FL蛋白都有另一类异型体,即由于第6外显子的选择性剪接在胞外区结构域的终端产生终止密码子,从而形成可溶性FL。笔者实验室也从人白血病细胞系J6-1克隆出胞外区有终止密码子的M-CSF。正常状态下KL的第6外显子含跨膜区和酶切位点;FL的第6外显子则否,诱导第6外显子可产生移动读码框形成的可溶性FL。

正常人血清KL水平为2~5ng/ml。患者血清KL水平变化尚未发现有临床意义。正常人血清FL水平100pg/ml,是免疫酶联检测法的检出极限。Fanconi贫血患者血清的FL水平可高达10ng/ml,放、化疗肿瘤患者血清FL水平也明显升高。

KL和FL对小鼠及人类造血细胞的作用:KL和FL对造血干、祖细胞的作用需有其他因子的协同。FL的作用偏重于淋巴系列;KL偏重于髓系。KL和FL之间也有协同作用。它们的受体,而不是因子是认识它们在造血调控中作用的关键,因为KL和FL在各种组织广泛表达,受体尤其是Flt3仅在有限的几种细胞表达。c-kit和Flt3在造血细胞系的表达已有许多报道。c-kit在髓系表达很低,大部分红系和巨核系高表达c-kit,肥大细胞系均表达c-kit,淋巴系则不表达c-kit受体。Flt3在造血细胞系的表达与c-kit明显不同。小鼠的髓系、红系、巨核系、肥大细胞系和巨噬细胞系均无Flt3表达,与人类的Flt3在造血细胞系的表达有所不同。

Flt3主要表达于造血祖细胞表面,其配体FL以膜结合型和分泌形式表达于骨髓基质细胞,在正常造血细胞的增殖、分化和生存中起重要作用。

c-kit受体和Flt3在人类白血病骨髓标本中的表达也有报道。在FAB分型的所有急性髓系白血病亚型的白血病原始细胞常见c-kit的表达,与相应正常造血干、祖细胞的表达水平相似。Flt3受体在多数AML也表达。急性淋巴细胞白血病则少见ckit表达。约半数Hodgkin淋巴瘤患者的Reed-Sternberg细胞有c-kit表达。B系急性淋巴细胞白血病Flt3受体均阳性,T系急性淋巴细胞白血病则报道不一致。T和B淋巴瘤则无Flt3受体表达。多数慢性髓系白血病急性变后有c-kit表达,部分患者在慢性期和加速期已有c-kit表达,但无Flt3受体表达。白血病细胞对FL和KL的反应性差异很大,对有些AML细胞系可以是自身调节因子(autocrine),有些则与别的细胞因子协同作用,也有的无反应性。KL 和FL在造血细胞增殖、分化调控中的作用和对造血细胞的体外效应,是用流式细胞仪和RT-PCR法测定的总结,是细胞群体的性质。造血细胞群体是高度异质性的,很难纯化。在判断这些结果时必须考虑方法学的限制。

已有的实验资料表明c-kit和Flt3的表达在造血系统主要限于造血干、祖细胞。随着造血细胞的增殖和分化c-kit和Flt3的表达有所改变,如定向髓系祖细胞是c-kit+Flt3+或c-kit+Flt3-的表型,而早期红系祖细胞仅为c-kit+Flt3-,因而KL对于红系祖细胞起关键作用而对FL不起反应。近期KL和FL对造血的体内效应研究表明,它们对部分分化了的造血细胞也起作用。c-kit在原始的、成熟的和恶性的肥大细胞都呈高表达,但是不表达Flt3。树突细胞的前体细胞也表达c-kit和Flt3,KL和FL与别的细胞因子协同对它们起作用,尤其是FL对髓系衍生的树突细胞起关键作用。尚有别的分化了的造血细胞表达c-kit和Flt3,但是生理功能尚不明。如约50%的小鼠骨髓嗜酸性粒细胞和单核细胞表达低水平的c-kit。小鼠骨髓还有小部分淋巴细胞表达Flt3。这些实验结果可能与细胞群体的高度异质性和方法学的限制有关。

CD34在人类骨髓细胞成熟过程中的表达。最早的干细胞也许是非组织决定、休止并有自我更新能力的。可能由于细胞基质的相互作用,获得了特异的表型和功能。看来,最早有自我更新能力的造血前体细胞是CD34-CD45+CD38+/-表型的细胞。这类细胞的激活导致CD34+表型的出现进而诱发了分化的后代。CD34+表型的激活是可逆的,激活的CD34+细胞有部分自我更新和植活能力,尤其是有其他抗原共表达,如CD90+,HLA-DR指示不成熟分化阶段用基因剔除技术获得的无FL或Flt3基因的小鼠一般说是健康的;相反,剔除KL或c-kit则是致死性的。剔除Flt3基因的小鼠有正常水平的外周血细胞。但是,深入研究发现早期B-细胞和造血干细胞数减少。若将剔除Flt3基因的小鼠交给c-kit基因有变异的小鼠喂养,则剔除Flt3基因的小鼠在20~50天内死亡。说明Flt3和c-kit基因是正常造血系统的发育和功能必须的。

剔除FL基因的小鼠也有正常水平的外周血细胞,一般说也是健康的,也有早期B细胞数的减少。但是,剔除FL基因的小鼠脾脏树突细胞的减少是剔除Flt3基因小鼠没有的。更明显的是脾脏NK细胞数的减少。

小鼠体内试验表明KL与TPO有协同作用促进血小板生成。给正常小鼠注射KL还可增加外周血白细胞总数,主要是中性粒细胞增加,淋巴细胞仅轻度增加。KL对骨髓细胞的影响不大,KL对脾脏髓系细胞和CFU-S的影响很明显。所以KL的体内作用机制复杂。

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