遗传病的基因诊断也适用于血液遗传病。本段在举例中将尽量结合血液病加以讨论。
基因诊断的基本依据是，生物的体细胞中含有该生物体的全部遗传信息。个体如果患有某种遗传病，则所有体细胞都带有这种致病基因。因而只要检测外周血、胚胎或胎儿的皮肤、羊水或绒毛细胞，脐带血，则可查出是否患有该病，或为该病的携带者。由于基因诊断是在发病前已经作出，故这种诊断法也称为“逆向诊断法”（reverse diagnosis）。
基因诊断的基本方法
一、DNA探针杂交是早期基因诊断技术的基础。诸如：DNA探针的制备（缺口翻译、末端标记）、核酸分子杂交（southern blot hybridization）、斑点杂交（dot blotting）和寡核苷酸探针杂交等。这些早期建立的方法，目前已经较少应用，它比较烦琐，经济和时间的耗费也多，还不能精确的基因病变的部位和性质。但是如果与下面介绍的PCR法结合起来，它们的价值仍然不可低估。例如使用于β地中海贫血的反向点杂交、PCR-ASO法（见后），又如检测α地中海贫血基因缺失或重复，结合内切酶（endonuclease）使用的核酸分子杂交法等。
二、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是1985年建立的具有划时代意义的一种新技术，后来在此基础上，发展和衍生了很多新的技术。这种技术的特点是，在短时间内，可以将感兴趣的一段DNA扩增到几百万个拷贝，使这段DNA通过显色，用肉眼都可以观察到。如果观察不到，则表示该基因组中缺失了这段DNA，如果位置（片段大小）发生了改变，则代表该基因发生了这样那样的突变。PCR技术有了很大的发展和开发出很多方面的用途，在这个基本原理的基础上建立了许多新方法。PCR的基本原理起源于DNA复制及核酸的变性与复性，现已经成为分子生物学实验室的常规技术，此不赘述。
PCR实验中，先根据需要扩增的DNA片段，从5'到3'的顺序合成一对大约20个碱基的寡核苷酸作为引物（primer）。反应体系含4种单核苷酸（dATP，dCTP，dTTP，dGTP，合称dNTP）、Mg2+，Tris-HCl缓冲液、引物、待扩增的DNA。先变性几分钟后，加入耐热的DNA聚合酶（Taq酶）。在聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不断延伸合成新的互补链。这样，这段DNA从一条变成2条。若继续按照变性（92～95℃）、复性（40～64℃）、延伸（72℃）的顺序循环25～40个周期，可以得到100万个以上拷贝。用溴乙啶染色（或银染），在荧光下（或肉眼）可直接观察到是否存在引物间的那段DNA片段。
遗传病的基因诊断
已知突变的基因诊断
一、缺失型突变的基因诊断
如大多数α地中海贫血都属于缺失型。在我国多数为东南亚型SEA，-20kb（α地1）、缺失3. 7kb或4，2kb的α地 2。如果为α地1的纯合子，临床表现为Bart胎儿水肿综合征。最早是在α基因的内部设计一对引物（引物的设计有较为严格要求，现在可以采用专门软件进行）。如果PCR反应出现特异性带，表明存在α基因，该个体正常；如果扩增后没有特异性带，说明两条DNA都缺失α基因，则可诊断为Bart水肿胎。目前对α地中海贫血杂合子和纯合子可以用一种称为缺口-PCR（gap-PCR）的方法进行诊断。即设计3条引物，一条在5'端（A），第二条在3'端（C），另一条在距5'端314bp左右处（B）（在5'端缺失部分内）（下图）。这样。三条引物在一个反应体系中扩增时，因为A、C相距约20kb，不能扩增，而A、B相距仅314bp，可以扩增出314bp的条带。这样，如果待测DNA正常，则仅能见到一条314bp带；如果为杂合子（即一条16号染色体上有正常的两个α基因，而另一条上完全缺失α基因），此时，可以见到除314bp的条带外，由于缺失的两断端融合，AC可以扩增出一条558bp的带。最后，如果两条16号染色体的α基因都缺失，则只能见到558bp条带而无314bp条带。这样，正常（αα/αα）、杂合子（--/αα）、Barts水肿胎（--/--）均可区别开来。
缺口PCR诊断Bart水肿胎引物设计与扩增结果示意图
同理，可以按同样方法设计检测只有3. 7kb和4. 2kb的缺失。
二、点突变的基因诊断
1）ASO法：检测点突变必须首先弄清突变的位置和性质。例如，β地中海贫血大多数为点突变。此时可合成等位基因特异寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO）探针，探针通常为20bp左右的核苷酸。用放射性核素或非放射性核素标记。用于检测点突变时一般需要合成两种探针：一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。这样，就可以把只有一个碱基发生了改变的基因与正常基因区别开来。
PCR可结合ASO，称为PCR-ASO技术。即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样就简化了方法，节约了时间，只要极少量的基因组DNA即可进行。多个基因的各种突变探针（可达106种）混合进行ASO，通过斑点杂交同时对500个样品进行检测，是此项技术的发展，如能对杂交阳性进行测序，更为准确。利用ASO原理，结合荧光标记探针和特殊的图像技术，发展出多种快速、高通量的突变检测技术，如TaqMan探针技术、分子信标（molecular beacon）、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）等。
2）反向点杂交（RDB）：如果同时需要检测多种某个基因突变，可以采用我国学者设计的“反向点杂交（reverse dot blot，RDB）”技术。例如，我国的β基因突变有10多种，RDB技术即预先将各种突变的ASO探针按方阵点在特殊的硝酸纤维膜上，干后，将膜浸泡在扩增出的β基因PCR产物中，通过显色反应，根据方阵上的显色杂交点，可诊断该基因发生了哪种突变。
3）突变特异性扩增系统（ARMS）：突变特异性扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）是较常用的简易检测单个碱基置换、插入、缺失或微缺失的方法。随着研究的深入，在表5-5中列出的各种血液病中，都陆续发现它们各自有多种不同的突变，有些达十几种或几十种之多。但是在同一种族或民族中却常见到只有几种，这就给采用ARMS法作基因诊断带来极大的方便。即可以设计几对针对突变的引物，在一次PCR反应中，检查出4～5种突变。这样就可以对90%以上的该病患者或携带者做出诊断。其他10%左右可以用测序补充。
4）直接测序（direct sequencing）：由于测序技术的发展和成本的大大降低，许多基因诊断实验室利用PCR产物扩增后直接测序的方法来进行突变的诊断。这种测序方法一般一次常规测序反应能读出平均700bp的有效长度，对于扩增片段较短，外显子较少的基因突变的检测尤其适用。近年来利用类似化学终止法DNA测序的原理，发展出高通量的突变检测方法，如利用引物延伸方法发展起来的焦磷酸测序技术（pyrosequencing），以及利用循环逆向终止方法（cyclic reversible termination，CRT）发展出的DNA测序方法（Solexa），可以应用于大规模的SNP检测和突变分析。
在此法的基础上还发展了双重和多重ASA（MASA）、颜色互补分析（colour complementation assay）、致变分离PCR法（mutagenically separated PCR，MS-PCR）等。
5）DNA芯片技术：又称基因芯片或微阵列（microarray）是指按特定的排列方式将大量基因探针或基因片段固定在硅片、玻片、塑料片等上。这是结合核酸分子杂交和高密度阵列分析产生的一种基因检测技术。应用于已知突变检测。现在已经开始探讨和试用于临床。
DNA芯片技术具有快速、大批量、自动化的优越性。适用于具有许多突变点的基因检测。目前已试用于CFTR、HIV、β珠蛋白、线粒体、BRCA1等基因的突变或单核苷酸多态性（SNPs）检测。也有人已试验双色探针进行突变检测、DNA或RNA的定量检测。此外，在许多基础研究（如代谢途径分析、基因表达及其调控、基因结构与功能鉴定等）和药物筛选等领域也有可能应用这种技术。但是，如果不需要同时检测大批量的某种基因突变，这种技术受到经济方面的限制。
6）定量PCR技术：一般的PCR都只能做到定性，在进行基因表达水平研究时往往需要定量。20世纪80年代起已经有人研究定量DNA为模板的PCR和RT-PCR（用反转录酶将DNA转录为mRNA后再进行PCR反应称为反转录PCR，即RT-PCR）。1990年有人用PCR反应稳定上升对数期的PCR产物来定量。但难以控制相同的模板量和扩增效率。例如血液病遗传病中，β地中海贫血在药物或基因治疗中，从RNA水平监测珠蛋白肽链表达水平的高低，对治疗效果的评价都非常有益。
TaqMan荧光探针定量PCR技术的工作原理示意图
现在采用较多的是竞争性PCR（quantitative competitive PCR，QC-PCR）进行定量，但此法准确性较差、烦琐、要求条件高。一般实验室不易操作。目前建立的一种定量PCR（real-time quantitative PCR），因为用荧光标记引物，通过检测荧光强度来确定PCR产物量。在此基础上发展出的TaqMan荧光标记探针技术，既能检测模板DNA或cDNA的量，又能检测特异性等位基因，其原理见上图。其应用特点是：
- 融合荧光PCR和等位基因特异性杂交技术，敏感度高、特异性强。
- 实时测荧光信号，判断有无扩增。密闭体系，无污染。
- 可定量DNA 或RNA模板数目，用于病情判断和治疗监测。
- 可设计双色或多色荧光标记探针，进行多重PCR反应，可同时检测正常和突变等位基因。
- 可设计成阵列方式，在一多孔反应板上检测多个突变。
目前该法已经应用于病原体、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及多态性研究。
未知突变性质遗传病的基因诊断
原则上，所有未知突变性质的遗传病都可以进行基因诊断。主要的方法是用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）做连锁分析。所谓RFLP是指不同个体的基因组DNA，如用同一种限制性内切酶去切割，产生DNA片段的长度各不相同。这种现象称为RFLP。其产生原理有二：①基因组DNA每隔100～200个碱基会出现一个中性突变，这一突变会增加或减少一个酶切位点。使切割的DNA长度不同；②基因组中存在多种重复顺序，但重复顺序因人而异。如果酶切点在重复顺序的两侧，则会因人而异地切出大小不等的片段。例如，甲型血友病是因第Ⅷ因子基因突变引起。此基因长达186kb，由26个外显子组成。虽然已经知道的缺失型和点突变有几十种，但大多数突变性质仍然未知。所以可以用RFLP进行基因诊断。其方法是，此基因的第18内含子有一个BclⅡ多态位点。如在两侧设计引物扩增出一142bp片段，再用BclⅡ进行酶切，则有些人可以切出99bp和43bp两个片段，而另外一些人则无此切点。通过连锁分析则可进行基因诊断。
一个X-连锁甲型血友病家系RFLP连锁分析结果示意图
上图是一个甲型血友病患者家系。先证者（Ⅱ3）有切点，基因型为99bp/-（常规电泳43bp不易见到，故有99bp片段就代表有切点），表明血友病基因与这一切点连锁。他的母亲（Ⅰ2）和他的同胞姐姐（Ⅱ1）查出基因型为142bp/99bp，因此如胎儿为男性，基因型为99bp/-，则胎儿极可能为患儿，应引产。如为142bp/-，则应为正常胎，应保留。有时单一位点分不清，则需要做多位点综合分析，称为单倍型分析（haplotype analysis）。这种方法，结合新近发现的各种遗传标记，已用于疾病基因定位分析。但是，随着时间的推移，未知突变的遗传病在理论上应该越来越少，所以，RFLPs的应用会逐渐减少。
产前诊断
产前诊断（prenatal diagnosis）是应用细胞和分子诊断的技术，对出生前的胚胎或胎儿进行遗传病诊断。由于从受精细胞分裂开始，所有体细胞都含有个体的全部基因组，所以原则上，能够进行基因诊断的遗传病，也能够进行产前基因诊断。但实际上，由于可以获得的胎儿细胞量极少、母体细胞污染和具有一定的创伤性，所以还不是一般实验室可以做到的。常规应用的是绒毛、羊水细胞和脐血。目前追求的目标：一是尽量早期，二是非创伤性。前者的热门话题是植入前遗传病产前诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD），后者则是母血分离胎儿细胞进行胎儿遗传病的诊断。有人在母体外周血血浆中发现胎儿DNA，并试图用母体外周血浆进行产前基因诊断。但母亲的血浆与胎儿血浆难以分离，所以，目前还只能用于胎儿是否男性和父亲是显性遗传病的基因诊断参考。
植入前遗传病诊断是指在受精卵卵裂后第三天，胚胎发育的4～8细胞期，取1～2个细胞或极体进行遗传学诊断，从而判断该个体是否患有某种遗传病。余下的细胞根据诊断结果决定是否植入继续妊娠。实际上，PGD是与体外受精（IVF）结合进行。这项技术在20世纪90年代由英国开始，已有超过40个国家和地区开展。主要的诊断手段是单细胞PCR和FISH技术。通过FISH可以查出21三体、18三体、13三体、X和Y染色体异常以及染色体易位。通过单个细胞PCR结合DGGE、SSCP、杂合双链分析、荧光PCR等技术，已经有下列单基因病（包括杂合子）诊断成功的报告：β地中海贫血、镰形细胞贫血、囊性纤维化、成骨不全Ⅰ、Ⅳ型、高氨血症Ⅰ型、中链氨酰辅酶A脱氢酶（MCAD）缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、视网膜母细胞瘤、脆性X、Bloch-Sulzberger综合征等。但这些诊断技术精确性、一次性判断的准确度、镶嵌体等问题，还需要积累更多的经验才能肯定对临床有应用价值。结合我国实际情况和PGD诊断的准确性，作者认为，目前在我国更应该发展和推广的还是羊水细胞和绒毛的产前诊断。
