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靶点新药虚拟筛选或计算机筛选

上述以已知靶点筛选先导化合物的要素是要有一个化合物库(compound library)或采用噬菌体显示技术(phage display technique)建立的肽库进行高通量筛选(high throughput screening),一般都要10万个化合物以上。它是通过收集和购买市售已知化合物积累而成,另一类是采用固相组合化学技术或噬菌体显示技术构建的。这些都是花钱、费时还需要大量人力的。新近开发的计算机筛选(computer screenig)或称虚拟筛选(virtual screening),是从已知靶点的X线衍射的原子坐标,通过一些专用软件在计算机上显示它的三维结构,已知靶点(包括受体、酶、抗原、因子和蛋白质)的X线衍射的原子坐标一般可以从蛋白数据库(protein data bank,PDB)下载获得,然后与已知化合物三维结构化合物库通过计算机定位(docking)技术进行搜索,寻找先导化合物。一般从10万个化合物可以得到一二十个候选化合物,再购进或合成它们进行生物试验,从中挑选先导化合物。这就大大地节省经费和时间。这个方法已在下列研究取得初步成功,从而显示它的发展前景:

  1. HIV蛋白酶抑制剂(HIV proteinase inhibitors)。
  2. 凝血酶抑制剂(thrombin inhibitors)。
  3. 神经氨酸苷酶抑制剂(neuraminidase inhibitors)。
  4. 整合素受体拮抗剂(integrin receptor antagonists)。
  5. FKBP结合蛋白配体(FKBP binding protein ligand)。
  6. HIV整合酶抑制剂(HIV integrase inhibitors)。
  7. 其他。

为了给读者一个简单轮廓,在下面举一些具体的例子加以说明,使读者容易理解。作为药物的外排泵P糖蛋白(Pgp),它的磷酸化是发挥外排功能的必要条件。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一种Ca2+、磷脂依赖性蛋白激酶,已经证实,激活的PKC使蛋白质磷酸化,从而产生各种生物学效应,在细胞的信号传递中起重要作用,尤其是证实PKC可通过影响Pgp磷酸化从而影响其运转功能,直接影响细胞内的药物浓度导致肿瘤细胞耐药。因此,除Pgp外,PKC自然成为一个重要的逆转MDR的靶点。

笔者开发出逆转MDR酚噻嗪类衍生物进一步研究它的作用机制时,发现它们对PKC的活性亦有明显的抑制作用。为了阐明酚噻嗪类对PKC靶点的结合反应,利用计算机DOCK对接技术,直观地在三维空间中考察配体小分子与受体大分子相互作用时的结合模式特征,从而为在计算机上进行虚拟筛选确定PKC靶点与三维化合物库的结合位点的模式。PKC晶体的X线衍射图证明它的激活剂PMA (phorbol myristate acetate)与PKC的结合位点是在PKC富含半胱氨酸(Cys 2)区的穴中的23Gly、21Leu 和12Thr以氢键结合。而PKC抑制剂Benzolactamide 与PKC的结合位点是在24Leu、20Leu和11Pro形成的疏水腔穴(hydrophobic pocket)以疏水键结合。

笔者以酚噻嗪类衍生物中抑制PKC高活性衍生物PTZ11和低活性衍生物PTZ6进行比较。首先用量子力学方法分别计算PTZ6和PTZ11分子最低能量占优势构象。两个分子的构象比较中可以看出PTZ6的酚噻嗪环是折叠的,而PTZ11则几乎呈平面状。将这两个分子分别与PKC抑制剂Benzolactamide分子进行重叠(overlap)处理,结果PTZ11与Benzolactamide重叠程度明显地比PTZ6高。将PTZ6与PKC富含半胱氨酸(Cys 2)24Leu、20Leu和11Pro形成的疏水腔穴对接图像显示,只有它的边链伸入到疏水腔穴里,而PZT6折叠的酚噻嗪环却不与疏水腔穴接触。与此形成对照,PTZ11除了能将它的边链伸入到疏水腔穴里,伸展的酚噻嗪环与疏水袋口的24Leu和11Pro结合紧密,整个分子与位点高度匹配。这就可以从与PKC靶点对接的图像匹配程度(能量高低)来说明酚噻嗪分子活性的高低。反过来,从对接开始可以利用分子与靶点匹配的程度(能量高低)来预测其生物活性的高低,可以从几十万个甚至上百万个的三维化合物库中挑选出几十个进行生物活性的筛选,在从中挑选高活性的作为先导化合物进行优化设计合成开发出新的药物。这就是计算机虚拟筛选的原理。另一方面从已知药物出发总结出来的一些药效团(pharmacophore),分析它们的立体和电荷特征进行库的搜索而得到匹配的先导化合物或药物。从虚拟筛选得到的CD4抑制剂与CD4结合的模式图。

以上介绍了21世纪新药开发的一些新的技术和途径。但不管从哪一种方法和途径得到的先导物,还得用经典的或常规方法进行生物活性的鉴定和体外体内的试验,药效和毒性以及药物代谢动力学的一系列临床前试验,才能申请临床试验。因此,这些方法能加速先导物的发现,从而促进新药的开发而且形成现代药物研究的新的流程:计算机试验(in silico)→体外试验(in vitro)→体内试验(in vivo)。

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