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以生物大分子为靶点:基于单克隆抗体的药物设计

以生物大分子作抗原,利用杂交瘤技术制备筛选出来的单克隆抗体是以生物大分子为靶点设计制备出来多肽药物的典型例子。它不同于体内固有的生物活性分子,如细胞因子、生长激素或胰岛素,它属于“人造”(artificial)分子。现在已在临床应用的抗CD3的单克隆抗体OKT3,抗Ⅱb/Ⅲa的单克隆抗体Reopro和抗B-淋巴瘤的单克隆抗体Rituxan就是这样制备筛选出来的。

单克隆抗体技术的发展,使越来越多的抗体应用于临床治疗和诊断。由于单克隆抗体多为鼠源性抗体,在人体内易产生免疫反应,限制了其重复使用。且这类抗体的分子量较大,肿瘤穿透能力较差。抗体人源化技术使单克隆抗体的免疫原性大大降低;另一些研究利用抗体噬菌体显示技术建立人源抗体库,通过对人源抗体库的筛选,获得亲和力较高的人源抗体。经分子小型化获得的小分子抗体Fv具有较高的肿瘤穿透能力;而利用基因工程方法获得的单链抗体(ScFv)既具有肿瘤穿透能力强的优点,又能克服Fv在溶液中不稳定的缺点。但无论是人源化抗体、人源抗体、Fv,还是ScFv,它们都是蛋白质多肽类物质,易被蛋白酶分解,因而在体内不稳定,不能口服。而且这类治疗剂的大量制备和纯化比较困难,生产成本较高。这些缺点限制了它们的临床应用。以多肽、蛋白质类治疗剂为前导物,利用化学合成的方法合成蛋白质多肽类治疗剂的非肽小分子模拟物可解决蛋白质、多肽类治疗剂存在的缺点。非肽小分子模拟物保持前导物药效基团的有效的空间排布及其功能构象,因此具有与前导物相同的生物功能。这类非肽小分子模拟物具有抗蛋白酶降解,无免疫原性,可口服等优点,且能跨越血脑屏障。

抗体-抗原结合位点的结构

抗体的氨基酸序列分析表明重链(H链)、轻链(L链)的N端为氨基酸序列可变的可变区(V区),而C端为序列较为恒定的恒定区(C区)。V区由序列高度可变的互补决定区(CDR)和序列相对保守的框架区(FR)组成。

在重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)各有3个CDR和4个FR,CDR和FR相间排列。CDR对抗体的特异性、亲和力起决定作用。FR与V区结构的维持有关,并间接影响CDR的构型、构象和功能。不同的抗体,组成各个CDR的氨基酸残基的种类、数量以及氨基酸序列各不相同,CDRH-3构象的多样性与抗体的多样性有关。除CDRH-3外,其他CDR的构象可由处于CDR以及FR中特定位点的保守氨基酸残基的组成准确地进行预测。抗体CDR的构象多为转角或环状结构。

来自VH、VL的6个CDR组成抗体-抗原结合位点,抗体-抗原结合位点呈突起、凹下、裂缝或袋状。抗体-抗原识别热力学研究表明处于抗体-抗原结合位点的少数氨基酸残基对结合能起主要作用,其他的氨基酸残基主要与抗体-抗原互补结构的形成有关。抗体-抗原反应结合能主要由氢键、范德华力、离子键组成,各CDR对抗体-抗原反应的贡献不同,抗体的亲和力以及抗体的特异性是由抗体-抗原结合位点和抗原表位在结构上和理化性质方面的互补决定。也就是由组成抗体各个CDR的氨基酸种类、数量、序列,以及氨基酸的理化性质决定的。虽然抗体-抗原结合位点由来自6个CDR的15~20个氨基酸残基组成,但直接参与抗体-抗原结合的氨基酸残基也就是4个左右。来源于CDR结构域的小分子多肽物质,具有与完整抗体相同的结合特异性和生物功能。研究表明在抗体-抗原反应过程中,组成抗体-抗原结合位点的CDR氨基酸残基的某些侧链基团直接参与抗体和抗原的相互作用。

抗体非肽小分子模拟物

CDR来源的多肽抗体

抗原的相互作用主要是处于CDR的少数几个氨基酸残基和抗原表位间的非共价结合。这意味着如果将这些直接参与抗体抗原相互作用的氨基酸残基作为一个整体分离出来,并保持它们在抗体-抗原结合位点上的空间构象,将能得到结合特异抗原的小分子多肽。这些来源于抗体CDR的小分子多肽物质,具有与完整抗体相同的结合特异性和生物功能。

抗体抗原复合物晶体结构的测定和分析,对参与抗原结合的关键氨基酸残基的确定非常重要。一旦抗体的序列和结构清楚,结合抗体结构与功能关系的分析结果,在计算机图像处理技术辅助下,可鉴定出参与抗体抗原相互作用的关键氨基酸残基,根据此合成一系列包括关键氨基酸残基在内的多肽类似物,经筛选可获得与完整抗体具有相同生物功能的小分子物质。这一策略已被用于研制抗原结合特异性的小分子肽。

Herceptin是抗乳腺癌的单克隆抗体它的靶点是HER2/neu。Park B-W模拟它的H链的CDR3的小肽称AHNP。分析几种AHNP类似物发现有两种结构特征可能影响环形肽的效力,一是环的大小,二是其扭曲性。C端残基对活性似乎也是关键部位。为了增加稳定性、折叠性和亲和力,作者使用芳香环改良法。为了扩大相互作用界面的表面面积,除了作为稳定性的半胱氨酸残基外还增加用做延长的3 肽MDV。

其中一种(FCGDGFYACYMDVP)显示中等活性IC50=100μM。HPLC分析发现它有两种优势形式,其中一个具有较高活性。测序结果发现3位Gly丢失。构建没有Gly3的AHNP模型显示,它比原来的AHNP的β-转角更似经典β-turn。与母体单抗重链CDR3重叠很好。在体外和体内的试验中显示与全抗有相同的活性。

mAb87. 96. 2是结合细胞表面Ⅲ型呼肠病毒受体的单克隆抗体,其CDRL-2与Ⅲ型呼肠病毒血细胞凝集素(hemagglutinin)具有同源序列。Williams等合成一系列包括mAb87. 96. 2的CDRL-2序列的多肽,经筛选获得多肽VL(KPG KTNKL LIYSGSTLQ)。多肽VL抑制mAb87. 96. 2和受体的结合,具有与mAb87. 96. 2相同的生物功能。

mAbF58是抗人HIV-1的抗体,Levi等合成包括抗HIV-1抗体mAbF58的所有CDR序列的多肽,经研究发现来源于CDRH-3的多肽CDLIYYDYEEDYY FDY能竞争性地抑制mAbF58和HIV-1的结合。

rAb23. 2是能和抗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抗体特异结合的重组抗体,其CDRL-1的序列和GM-CSF的B区具有同源性,能和GM-CSF受体结合,Monfardini等据此合成环肽1786(C* GTAEGKGGKGTA SAKGGC*)。环肽1786能被抗GM-CSF抗体识别并结合,竞争性抑制GM-CSF和HL60细胞表面GM-CSF受体结合,逆转GM-CSF抑制Mo7E细胞凋亡的生物活性。这些研究结果表明可以利用具有生物活性的抗体为模板,设计并合成与抗体具有相同活性的小分子多肽及其他治疗剂。

多肽在溶液中可采取许多不同的构象。构象的不稳定性降低了多肽结合抗原的亲和力。Williams等在线性多肽VL插入两个半胱氨酸,经氧化作用形成分子内二硫键,获得环肽VLC9C16(KPGKTNKLC IYSGSTCQ),它对配体的亲和力比线性的多肽VL高40倍。环化的1786和线性多肽1786相比具有更高的亲和力和生物活性。Levi等研究发现来源于mAbF58CDRH-3的环肽能抑制HIV-1复制、抑制感染细胞中合胞体(syncytium)形成,而线性肽则不能。

抗体非肽小分子模拟物

小分子肽虽然具有特异结合抗原的活性,但易于被蛋白酶降解,且具有潜在的免疫原性。以这些肽为前导物,依据它们的功能基团的组成及功能基团的空间构象,合成与它们具有相同构象的非肽小分子模拟物,可克服上述的缺点。

化学合成的化合物库的筛选、天然产物筛选、微生物代谢产物的筛选是传统的新药寻找的方法,也是获得多肽模拟物的最简单的方法,但该法具有一定的盲目性,且周期较长。随着分子生物技术、X线晶体测定技术、计算机技术、药物化学合成技术的发展,基于蛋白质二级结构的多肽模拟技术得到发展,目前大部分的多肽模拟都是对蛋白质二级结构的模拟。α-螺旋、β-折叠、β-转角等二级结构单元是蛋白质高级结构构建的基本单位。

β-转角改变肽链的走向,对活性蛋白质正确构象的形成和稳定起重要作用,位于蛋白质外表面的β-转角在蛋白质的相互识别中起重要作用。基于β-转角结构较为简单及其在蛋白质的相互识别中的重要作用,目前多肽的模拟多数是对β-转角的模拟。β-转角的模拟主要有2种情形。一种是β-转角的模拟物当插入多肽链后,形成正确的转角构象,药效基团处于正确的空间位置,从而表现出生物活性。另一种β-转角的模拟物本身能稳定某种构象,这种构象和前体蛋白质或多肽中β-转角的构象相似,在多肽的其他部分缺失时,β-转角的模拟物亦具生物活性。

在抗体-抗原识别中起重要作用的CDR为设计合成新的治疗剂提供了很好的模板。组成抗体抗原结合位点的CDR多为转角或环结构。单克隆抗体NC41特异结合唾液酸酶N9,并抑制唾液酸酶N9的活性,研究抗体NC41和唾液酸酶N9复合物的晶体结构,发现CDRH-3对抗体-抗原反应起重要作用,Smythe等合成模拟物,研究表明该模拟物抑制N9唾液酸酶的活性。mAb7. 16. 4在体内外能抑制p185neu介导的细胞转化。来源于抗p185neu蛋白抗体mAb7. 16. 4的模拟物能下调B104-1-1鼠成纤维细胞癌基因p185neu受体的活性通过对抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体和TNF-α受体进行比较,发现TNF-α受体的WP5结合位点和抗TNF-α抗体CDRL-1具有结构同源性,依据这些关键序列合成的模拟物WP5N(YCFTNSENHCY)能抑制TNF-α和细胞上TNF-α受体结合。依据TNF-α受体3区1环的WP9结合位点序列合成的模拟物WP9QY,抑制TNF-α和细胞上TNF-α受体、可溶性TNF-α受体结合,抑制TNF-α诱导L929细胞凋亡,75μmol/L WP9QY能保护90%L929细胞免于TNF-α诱导的凋亡,其抑制活性呈剂量依赖性。

抗体非肽小分子模拟物研制成功与否决定于两个因素,一个因素是参与抗体-抗原反应的关键氨基酸残基的鉴定,以及这些残基的侧链基团在三维空间排布的测定;另一因素是根据这些测定结果利用药物化学合成的方法合成小分子多肽模拟物。抗体模拟的基本过程如下图所示。

 抗体模拟的基本过程

抗体模拟的基本过程

Whilliams等依据mAb87. 96. 2的CDRL-2的39~54序列合成多肽模拟物87. 1,多肽模拟物87. 1的结合特异性和生物活性的测定结果表明,模拟物87. 1能抑制mAb87. 96. 2和Ⅲ型呼肠病毒细胞受体的结合,抑制ConA(concanavalin A)诱导T淋巴细胞增殖的活性。模拟物87. 1和mAb87. 96. 2同时进行胰蛋白酶、血清蛋白酶处理,然后测定它们的生物活性,结果发现模拟物87. 1抑制ConA诱导T淋巴细胞增殖的活性没有丧失,经胰蛋白酶、血清蛋白酶处理的模拟物87. 1仍抑制mAb87. 96. 2和细胞受体的结合,而mAb87. 96. 2生物活性丧失。这些结果表明模拟物87. 1模拟了mAb87. 96. 2的结合特异性和生物活性,且能抗蛋白酶的降解。由于抗体模拟物分子较小,可以想象其结合抗原的亲和力较完整抗体的亲和力低,但抗体模拟物的亲和力可通过进一步稳定适合的构象或其他方法修饰得以提高。

Degrado等利用半钢性的连接链间-氨甲基苯甲酸(m-aminomethyl benzoic acid)将多肽GRGD的两端连接起来使合成肽的构象更为稳定。依据抗体的结合位点中疏水性氨基酸残基和芳香族氨基酸对抗体抗原反应起重要作用,Zhang等依据CD4的第一结构域CDR3的序列合成经芳香族氨基酸修饰的模拟物CDR3 AMES(82~89),体外实验表明CDR3 AMES(82~89)抑制MHCⅡ、gp120结合CD4,抑制HIV-1在CD4阳性细胞中复制。浓度为10μmol/L时,模拟物CDR3 AMES(82~89)即能抑制gp120结合细胞表面CD4,浓度为80μmol/L时,抑制活性达80%。浓度为35μmol/L时,模拟物CDR3 AMES (82~89)完全抑制反转录酶的活性,其作用效果和10μmol/L浓度的AZT相似。随着抗体-抗原反应机制的进一步了解,药物化学合成技术的发展,抗体模拟物的亲和力将进一步得到提高。以抗体为模板的抗体模拟技术必将推动药物研究的发展。

抗体模拟的应用前景

抗体模拟是一门新兴的技术,作为模拟物的模板,单克隆抗体具有其他蛋白无法比拟的优点:①单克隆抗体易于制备和纯化。②越来越多抗体的晶体结构和序列的测定,使抗体CDR的构象的预测越来越准确。③计算机技术已成功地模拟抗体的三维结构。④抗体的特异性高,且抗体的功能和治疗效果已得到证实。

以抗体为前导物对抗体-抗原结合位点进行模拟所得的模拟物,与完整抗体具有相同的结合特异性和生物活性。基于抗体结构的抗体模拟技术具有广阔的应用前景。对细胞生长和分化起调节作用的细胞因子可作为治疗的靶点。以抗这些细胞因子的抗体为模板,可设计并合成用于肿瘤治疗的抗体非肽小分子模拟物,这是开发肿瘤治疗药物的很好策略。

受体在细胞信号传导过程中起重要作用,许多受体可作为治疗的靶点,抗体对受体不同部位的结合引起受体不同的效应,以这些抗体为前导物,利用抗体模拟可开发受体激动剂、拮抗剂,以寻找选择性较好、毒副作用更小、疗效更佳的药物。该类模拟物还可用于受体结构与功能分析。

许多在各种生理过程中起重要调节作用的酶可作为治疗的靶点,酶抑制剂是一大类治疗剂,酶抑制的专一性越高,作为治疗剂其选择性越好,毒副作用越小。利用单克隆抗体技术制备能特异抑制酶活性的单克隆抗体,对特异抑制酶活性的抗体进行模拟可获得酶的特异抑制剂,该类抑制剂能特异抑制酶的活性。

抗体模拟可用于免疫反应机制和抗体成熟机制的研究。对抗独特型抗体的模拟可为人工合成抗原表位、为合成疫苗的开发研究、抗体化疫苗的开发研究提供实验方法和理论指导。抗体模拟物与化疗药物或毒素连接,制备用于肿瘤导向治疗的免疫耦联物或免疫毒素,这类免疫耦联物、免疫毒素克服了现有的用于肿瘤导向治疗的免疫耦联物、免疫毒素的缺点,具有分子量小、低免疫原性、稳定性好等优点。

抗体模拟物可作为研究大分子物质的结构与功能关系的探针,抗体模拟物为研究抗体-抗原相互作用、蛋白质间相互识别和相互作用、蛋白质的结构与功能关系提供了有力的工具。抗体模拟物二聚化的研究,双功能抗体模拟物的研究,使抗体模拟的应用前景更为广阔。组合随机肽库技术、化学合成肽库技术、噬菌体抗体库技术的发展,将为抗体模拟提供更多的模板。

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