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血液病的基因诊断

疾病的诊断方法大致有4类:临床诊断、血清学诊断、生化学诊断以及基因诊断。前3类方法是根据临床表现、血清学检验和组织、细胞与生化学检测作的诊断。这些方法都是以疾病表现改变为依据,而表现的改变很多不是特异的,出现的时间往往较晚,因此有不能明确诊断和延误病情的危险。近年来由于基因分子生物学知识的迅速积累,我们已经知道作为生命的物质基础——基因的改变会导致各种表型的改变,进而引起疾病的发生。探测基因的存在,分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常,从而达到对疾病做出早期和确切的诊断,这就是基因诊断。基因诊断也包括mRNA的检测,因为mRNA是基因转录的产物。

遗传性血液病的诊断采取什么方法,主要依据其突变的特点。如β-地中海贫血源于疟疾地区,受到外界因素的正向选择。全世界已发现的突变类型虽有100种以上,但常见的仅有20种,占基因总数的90%。在一个地区常见的类型往往只有几种,不同民族又有其特有的类型。如中国人已知的突变有27种,而常见有的仅4、5种。这类血液病如β-地贫、G-6-PD等的已知突变多采用直接方法进行检测,如点突变用等位基因特异寡核苷酸探针(ASO)斑点杂交技术。通过杂交可以确切判断患者是否有这种突变、是杂合子还是纯合子。如不是这种突变,可以进行另一种突变探针的杂交,直到检验出突变为止。

另一类如甲型、乙型、假性血友病等,虽然它们的分子机制已基本清楚,但基因突变的类型多种多样,位置遍及整个基因,有高度的异质性。这类疾病也可以用间接诊断法,即应用DNA多态性遗传标志进行家系连锁分析。连锁是指一个多态性位点与一个基因在同一条染色体上并且位置接近,因此二者可以一起被遗传,前者可作为后者的标志。通过家系成员的DNA多态性分析并结合其表现型(是某种遗传病的纯合子、杂合子或正常),可能判断某一多态性等位基因与缺陷基因或正常基因连锁。

DNA多态性分为三代。第一代为限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP),是由于多态性导致了限制性内切酶识别位点的改变。第二代为与简单串联重复序列(simple tandem repeat,STR)多态性。STR是新一代的遗传标志,也称为微卫星,是指2~6bp的串联重复序列。它广泛分布于人类基因组中,具有高度的长度多态性,信息量高。如FⅧ基因中已发现有4 个STR,分别位于内含子6、13、22与25中。其中内含子13的CA重复序列,有8个等位片段,杂合频率大于50%。中国人的杂合频率在60%左右,约相当于bcl-1与Xba-1 RELP两者联合应用时的杂合频率。STR显然优于RFLP,因此愈来愈多的被人们所采用。第三代是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是遗传变异的一种重要形式,约占已知多态性标记的80%。虽然每个SNP所携带的信息量比STR少,但它们出现的频率高,在人基因组中大约平均每1000碱基中就会有一个SNP,并且有很高的遗传稳定性,因此在家系连锁分析中有巨大应用潜力。

多态性遗传标记在基因诊断中所能提供的信息量一般用两个指标衡量。一个是杂合度,一个是多态性信息量。杂合度(heterozygosity)是指群体中某个多态性遗传标志为杂合状态的个体所占的百分数。当个体为某一致病基因杂合子时,仅当与此基因连锁的遗传标志为杂合状态时才能区分哪一等位片段与正常基因或致病基因连锁。计算公式为:

杂合度 公式

其中n为等位片段个数,pi为等位片段频率。

应用连锁分析时,如果双亲为某个多态性的纯合状态,则不能提供信息;父母虽是某个多态性的杂合状态,但基因型相同,如果子代也是同样的基因型,则只能提供50%的信息(只能准确诊断受检者是致病基因杂合子,但不能区别是完全正常还是患病),由此引入多态性信息量这一概念。多态性信息量(polymorphic information content,PIC)是指某一多态性位点能够作为遗传标志进行连锁分析的概率。PIC小于该位点的杂合度。对于常染色体上的多态性标记的PIC的计算公式如下:

多态性信息量计算公式

其中pi和pj分别为第i个和第j个等位片段在群体中的频率,j=i+1。

不论是采用RFLP或STR或SNP连锁分析,都具有一定的局限性:①家系中的关键成员(父母,X连锁遗传病的母亲)必须为杂合子,这样才能从同源染色体中区分哪一条染色体具有缺陷的致病基因。②子代中存在患病的纯合子或双重杂合子,这样才能确定致病基因与哪条染色体连锁。③有时分析一个多态位点还不能区分出父母致病基因所在的染色体,则必须分析多个位点,综合起来才能获得足够的信息。一条染色体上两个或两个以上多态性位点的组合称为染色体单体型。④受检的亲代必须为生物学意义上的亲代。此外,在细胞分裂过程中,一对染色体的某些区域可发生重组或交换,从而使得原先共同遗传的DNA突变与遗传标志发生分离,这种情况下做出的连锁分析结果就会发生错误。诊断的错误率可以以DNA标志与疾病的共遗传程度来估计,重组率高于5%的遗传标志不宜采用。特别值得注意的是这种间接的基因诊断方法是基于临床对先证者的诊断,通过家系分析推断出来的。如果临床的诊断有误,由此而得到的基因诊断结果也就成完全错误的。所以间接基因诊断法不能对患者直接做出诊断,主要用于携带者鉴定与产前基因诊断。因此,在有条件的情况下,要尽可能地采用直接检测基因突变的方法进行基因诊断和产前基因诊断。

目前多采用PCR扩增技术测定RELP与STR的多态性。二者仅在扩增后分离等位片段的方法上有所差异。检测RFLP时,PCR后的产物要用限制酶水解,电泳分离,EB染色后可在紫外灯下直接读出结果。检测STR时,对于PCR扩增产物中2~3个核苷酸重复序列的差异一般采用序列胶分离,银染或同位素标记显示。大于3个核苷酸的STR,用聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB染色即可。

基因诊断在血液病中另一方面的应用是对造血系统肿瘤微小残留瘤细胞的检测。由于非随机性染色体易位在造血系统肿瘤中较常见,且某些特异性易位常和某特定的疾病相关,易位后生成的融合基因与其表达产物嵌合mRMA成为该病的特异分子标志,可以进行检测。如前所述,慢性粒细胞白血病是t(22;9)(q13;q25)易位,易位后生成了bcr/abl融合基因。早幼粒细胞t(15;17)(q22;q11. 2)易位生成该疾病的特异性分子标志RARα/MYL mRNA。又如急性粒细胞白血病M2b型中90%具有特异染色体易位t(8;21)(q22;q22),这一易位累及21号染色体的AML基因和8号染色体的ETO(eighttwenty one)基因,转录出AML/ETO mRNA。T(14;18)(q32;q21)的易位见于淋巴瘤,易位涉及bcl-2 与IgH基因,生成bcl-2/IgH mRNA。

残留肿瘤细胞的检测可用PCR或RT-PCR,目前后者应用更广泛。例如CML形成的bcr/abl融合基因,在DNA水平上其断裂点多变不定,而剪切后的CML mRNA却只形成2种不同的转录形式(下图)。一种是BCR第2外显子与C-ABL第2外显子连接(b2a2),和BCR第3外显子与C-ABL第2外显子连接(b3a2)。因此,用RT-PCR检测融合基因的表达产物mRNA更为合理可行。RT-PCR就是用反转录酶从患者外周白血细胞或组织提取的总PolyA RNA反转录成cDNA,再以嵌合位点两侧的引物进行PCR。PCR产物经电泳与Southern转移,与嵌合位点的探针杂交,从放射自显影图谱即可作出诊断。PCR时应以相应的细胞株作阴性和阳性结照。本方法灵敏度极高,可测出极少的残存瘤细胞。如1μg K562细胞的RNA,稀释10倍还可测到嵌合结构。

 CML嵌合mRNA的结构及PCR寡核苷酸引物与探针的位置;EXON:外显子

CML嵌合mRNA的结构及PCR寡核苷酸引物与探针的位置;EXON:外显子

约有5%的ALL可以用引物(E、F)进行PCR,以G为探针进行诊断,用于对这部分ALL与CML的鉴别诊断。

巢式PCR(Nested PCR)可以进一步提高方法的灵敏度与特异性。在PolyA RNA反转录成cDNA后,用2对套叠的引物,进行两次PCR(下图)。先用外侧的C,D引物扩增,再取少量PCR产物用引物A,B进行第2次扩增。两种不同的mRNA可以得到不同长度的特异扩增带。巢式PCR可从10个正常细胞中检测出1个携带BCR/ABL融合基因细胞,灵敏度更高。

 巢式PCR检测bcr/ABL引物与探针的位置及产物的长度:A、B、C、D.表示引物;E.表示探针

巢式PCR检测bcr/ABL引物与探针的位置及产物的长度:A、B、C、D.表示引物;E.表示探针

检测微小残留细胞对不同造血系统肿瘤复发和预后的意义不完全相同。如APL微小残留细胞的检测有高度的预测性。单独用反维A酸(ATRA)诱导缓解的患者不能根除微小残留瘤细胞,复发率高。在ATRA诱导缓解后,继用化疗巩固,90%的患者RT-PCR检测呈阴性。RT-PCR检测瘤细胞长期阳性的患者以及RT-PCR阴转阳的患者都有复发。相反,曾报道有3例AMLM2b[t(8;21)]长期缓解的患者,持久有微小残留瘤细胞而无复发迹象。如用干扰素治疗或骨髓移植后的CML患者,尤其在骨髓移植后6个月,大部分用PCR仍可检测到bcr/abl的转录物,而骨髓细胞正常,血象缓解,没有很快复发的迹象。这种现象虽有不同的解释,但尚待于长期连续的检测和研究。只依据个别的PCR检测结果还不能准确判断患者的预后。滤泡性淋巴瘤[t(14;18)]微小残留瘤细胞的检测意义,各实验室结果也不一致,有待于进一步研究和问题的澄清。

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