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  4. 红细胞膜的结构与功能

红细胞膜的组成:膜脂质、膜蛋白、膜酶、膜糖

红细胞在低渗溶液中破溶,Hb等内容物溢出,可得到较纯的红细胞膜,称为血影(ghost)。人红细胞膜由蛋白质、脂质、糖类及无机离子等组成,其中蛋白质占49. 2%、脂质43. 6%,糖类约8%。与其他细胞相比,红细胞含脂质较多。

膜脂质

磷脂与胆固醇

膜脂质主要由磷脂及胆固醇组成(下表)。其中磷脂占60%,胆固醇和中性脂肪占33%,其余是糖脂类化合物。磷脂主要是磷脂酰胆碱(PC),占28%;磷脂酰乙醇胺(PE),占27%;磷脂酰丝氨酸(PS),占14%;鞘磷脂(SM),占27%;磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱等约占2%~3%。各种磷脂所含的脂肪酸都不同,一般规律在甘油的α-碳联结的是饱和脂肪酸,β-碳联结的是不饱和脂肪酸。各种磷脂肪酸含量。但脂肪酸含量不稳定,依饮食及外环境的改变而异。红细胞不能合成脂肪酸,主要与血浆中的脂肪酸进行交换更新。磷脂中以PC交换最快,1%/h,SM最慢。红细胞膜上的非酯化胆固醇与血浆中非酯化胆固醇交换很快,由于血浆内卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(lecithin-cholesterol acetyltransferase)可将胆固醇酯转化成胆固醇,所以膜与血浆中胆固醇可很快达平衡。

红细胞膜脂质组成

红细胞膜脂质组成

红细胞膜磷脂中脂肪酸的含量(占总脂肪酸的%)

红细胞膜磷脂中脂肪酸的含量(占总脂肪酸的%)

注:+表示含量不足1%

糖脂

糖脂有多种,红细胞膜的糖脂主要是鞘糖脂。鞘糖脂是以鞘氨醇为骨架,通过酰胺键与一个脂肪酸相连,其极性头部是单糖或多糖。红细胞膜中的鞘糖脂由于糖的组分及结构的不同,也有多种;糖与糖的连接很复杂,有1-3,1-4,1-6连接,还有支链结构,所以鞘糖脂的种类很多。鞘糖脂有许多功能,如红细胞上的血型物质都与糖脂结构有关。

膜蛋白

红细胞膜蛋白分为外周蛋白和内在蛋白。采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE),用考马亮蓝染色,可将红细胞膜的蛋白质分成7(或8)条主带,按Fairbanks命名为1、2、3、4、5、6、7、8。用过碘酸-雪夫试剂染色(PAS染糖蛋白)可见4条带。当红细胞膜用Triton x-100处理约1小时,去除大部分膜磷脂及胆固醇,余下的膜在相差显微镜下观察仍为双凹圆盘形,这时的膜组成有区带1、2、2. 1、4. 1、4. 9及5,这些蛋白被称为“膜骨架蛋白”(cytoskeleton protein)或Triton壳(Triton shell),它们在维持红细胞形态及功能上起着重要的作用,参见下表1。其基因特点参见下表2。再有网织红细胞与成熟红细胞膜蛋白也有不同,在成熟过程中一些膜蛋白丢失,如转铁蛋白、胰岛素受体、纤连蛋白受体在成熟红细胞内没有。

红细胞膜的主要蛋白质

红细胞膜的主要蛋白质

注:*Adducin:加合蛋白。有αβ两种亚基

* *Dematin,P55这两种蛋白在SDS-PAGE都在带4. 9位置,所以写在4. 9的后面,但不是同一个蛋白

膜蛋白的基因特点

膜蛋白的基因特点

注:HE:遗传性椭圆形红细胞增多症(hereditary elliptocytosis);HPP:遗传性热变性异型红细胞增多症(hereditary pyropoikilocytosis);HS:遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis);SAO:东南亚卵形红细胞增多症(Southeast Asian ovalocytosis);RTA:肾小管酸中毒(renal tubular acidosis)

一、区带1和2蛋白总称为收缩蛋白(spectrin)。位于红细胞膜的内侧,满布于胞质中,有伸展及收缩功能,是红细胞膜骨架蛋白中最主要的组成部分。收缩蛋白由α和β亚基组成,分子量分别为240kD 和220kD。α亚基和β亚基的结构极相似,二者的氨基酸顺序已完全清楚。α亚基有22个片段,1~9 及12~19片段有高度同源,称重复单位,每个重复单位有106个氨基酸;第11、20、22片段同源性较差;第10及22片段有150个氨基酸。如用胰蛋白酶水解,可形成5个区,即αⅠ~αⅤ。许多遗传性溶血病,变异多集中在αⅠ区。β亚基由19个重复单位组成,用胰蛋白酶水解,可分4个区,称βⅠ~βⅣ。C端有4个磷酸化部位,可被酪蛋白激酶磷酸化。αβ亚基扭曲在一起成麻花状,形成二聚体,二聚体再以头-头相连形成四聚体,红细胞膜上多以四聚体形式存在。在0℃下提取的收缩蛋白多为四聚体(约占90%),少量二聚体;而在37℃、ATP存在下,四聚体易解离成二聚体。在电镜下观察,还可见八聚体或寡聚体。α和β亚基的尾部(α亚基的C-末端,β亚基的N-末端)可与区带5、4. 1蛋白联结。α亚基上有钙调蛋白及SH3结合区。β亚基上有2. 1蛋白联结部位和磷酸化部位,通过2. 1蛋白还可与带3蛋白联结。

二、在区带2~3之间可见多条小带,分别称2. 1…2. 5等蛋白。2. 1蛋白又称“锚蛋白”(ankyrin),分子量为200kD,一分子2. 1蛋白可与一个收缩蛋白四聚体结合。2. 1蛋白可分三部分:一部分是N-末端区,分子量为90kD,有与区带3蛋白结合部位;中间部分为62kD,有与收缩蛋白结合位点;C-末端为55kD,此区又称可变区或调节区。实验发现2. 2及2. 3蛋白可与2. 1蛋白的抗体发生反应,推测它们的主链部分是一样的,有可能是2. 1蛋白的变异体。

三、区带3蛋白是贯穿膜脂双层的内在蛋白,多以二聚体形式存在,分子量约为93kD。它与水及阴离子(Cl-,HCO3-)运转有关,所以又称为“阴离子通道”。化学组成分析,它是糖蛋白,大约含5%~8%的糖(半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、乙酰氨基半乳糖)。用胰糜蛋白酶水解带3蛋白,可将其分为三部分:膜外侧近血浆面(C-末端),含有大量糖;跨膜区,肽链多由疏水氨基酸组成,穿过膜14次,靠近膜内侧富含赖氨酸残基,带正电荷,可能即是转运阴离子的部位,HCO3-与Cl-交换,运转速度极快,每秒可运转1010~1011个分子;第三段伸入胞质区(N-末端),这一段多肽很活跃,有大量酸性氨基酸残基,可与血红蛋白(Hb)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(G-3-PD)、醛缩酶、区带4. 1、4. 2及收缩蛋白等许多蛋白结合。带3蛋白其运转特点是双向的,依生理条件而异,以此来维持离子平衡。

四、区带4蛋白位于红细胞膜内侧,在电泳图谱中可分为几条小带,分别称为4. 1、4. 2…4. 5蛋白等。

1)4. 1蛋白:由两个亚基组成,分别称为4. 1a (80kD)和4. 1b(78kD)。4. 1a/4. 1b在正常红细胞中是有一定比值的。用凝乳蛋白酶处理,可将蛋白分为四个区,第一区(N-末端)是30kD的片段,富含半胱氨酸,糖基化及磷酸化部位均在此,最近报道在此区还可与PICLn蛋白结合。PICLn是ICLn基因编码的蛋白,分子量约26kD,依赖Cl-的变化,调节细胞体积(cell volum)及形态;第二区是16kD;第三区是10kD,有与收缩蛋白结合的位点;第四区(C-末端)是可变区。4. 1a与4. 1b的第1~第3区极相似,只是在第四区有差异,4. 1a是24kD,4. 1b是22kD,二者只差几十个氨基酸残基。现有4个新基因4. 1R;4. 1G;4. 1N及4. 1B。它们所表达的蛋白4. 1R;4. 1G;4. 1N及4. 1B分别存在不同的细胞及组织,在红细胞膜上只有4. 1R蛋白。

2)4. 2蛋白:分子量约为72kD,在膜内多以寡聚体形式存在,可与带3蛋白、2. 1及4. 1蛋白结合,以稳定2. 1蛋白与带3蛋白的结合。日本分析一例4. 2蛋白缺失的患者,由于在142编码部位有点突变,导致GTC变成ACT。这种患者带3蛋白明显减少,进一步说明4. 2与带3蛋白的结合。

3)4. 9蛋白(dematin):是新发现的一种蛋白,有3个亚基:一个52kD,两个48kD。在溶液中以二硫键交联形成二聚体,在电镜下可见三个环结构,可与区带3蛋白结合,极易被cAMP-依赖的激酶、Ca2+激活的激酶及蛋白激酶C磷酸化。可能以磷酸化及脱磷酸化调节结构变化。

4)P55蛋白:是分子量为55的蛋白,由于分子量与4. 9接近,在SDS-PAGE中在4. 9的位置。过去不了解,最近其蛋白结构已清楚,含有PDZ (PSD-95/discs large/ZO-1)结构域,SH3及GUK (guanylate kinase like)结构域。现已发现许多与P55相类似的蛋白,已成为MAGUK(membrane associated guanylate kinase)家族。P55与棕榈酸结合,从而依赖脂肪酸插入质膜。P55在红细胞膜上不是单独存在,它与4. 1蛋白、血型糖蛋白C形成聚体,维持膜的稳定性。4. 1蛋白缺失,会导致P55的丢失。已知在P55氨基端的30个氨基酸的地方与4. 1蛋白结合。

五、区带5蛋白即肌动蛋白(actin),分子量为45kD,结构与肌肉中提取的肌动蛋白极为相似。红细胞的肌动蛋白有两种形式:一种是纤维状(factin),由12~14个肌动蛋白聚合而成,约长7nm,在电镜下可见长的纤维;另一种是球状(gactin)。肌动蛋白与收缩蛋白结合时是球状,与质膜相连时是纤维状的。

在此区内还有一个蛋白称原肌球调节蛋白(tropomodulin),分子量为43kD。它是原肌球蛋白与肌动蛋白结合的产物,可稳定原肌球蛋白与肌动蛋白形成的微丝,可能与细胞分化及细胞形态发生有关,但还有待进一步证实。

六、区带6蛋白位于红细胞膜内侧,分子量为35kD,具有3-磷酸甘油醛脱氢酶活性。

七、区带7蛋白分子量为29kD,有人认为它似肌钙蛋白,也有人认为它有Ca2+-ATP酶活性。与此分子量很相近的还有一个蛋白称原肌球蛋白(tropomyosin)。由于它分子量与区带7蛋白接近,在SDSPAGE中与带7同区。但不是同一个蛋白。它有两个亚基,分子量为29kD及27kD。每个红细胞有7万~8万个分子。每个分子原肌球蛋白可与6~7个肌动蛋白单体结合。由肌动蛋白组成的纤维状肌动蛋白,约有33~38nm,相当于12~14个肌动蛋白单体,其长度正好与肌球蛋白二聚体的长度相似,所以提出原肌球蛋白是束缚肌动蛋白的,以保证它的生理功能。

最近报道在红细胞膜上又找到一个蛋白称口蛋白(stomatin),分子量为31kD,与区带7相近,称7. 2b蛋白,可能与离子通透有关。7. 2b它还有两个同型物,SLP-1、SLP-2(stomatin like protein-1,2),SLP-1存于非红系细胞,SLP-2存在于成熟红细胞膜上,可与膜内在蛋白及骨架蛋白结合,以调节离子转运。

八、加合蛋白(adducin) 加合蛋白是由2个为100kD和105kD的亚基组成,电镜下呈不规则盘状,厚5. 4nm,直径为12. 4nm。每个红细胞有3万个分子。加合蛋白与收缩蛋白及肌动蛋白复合体结合,在其亚基上有与钙调蛋白的结合点,在Ca2+存在下,可与钙调蛋白形成Ca2+-钙调蛋白-加合蛋白复合体,使收缩蛋白与肌动蛋白结合减弱。因此,加合蛋白通过Ca2+和钙调蛋白影响骨架稳定性,从而影响红细胞的形态。

九、若将红细胞膜SDS-PAGE用过碘酸-雪夫试剂(PAS)染色,可见四个区带,称:GPA(或称PAS1)、GPB(PAS2)、GPC(PAS3)及GPD(PAS4),总称血型糖蛋白(glycophorin,GP)。由于它们富含涎酸(sialic Acid),所以又称涎糖蛋白(sialoglycoprotein),最近发现一个GPE,与GPA相似(下表)。

  1. GPA:分子量36kD,富含糖,蛋白质分子量只有~14kD,结构分3个区:胞外区,1-17个氨基酸,有15个0-糖苷键的4碳糖及一个含有大量唾液酸的寡糖,是红细胞表面带负电荷的主要来源,在防止红细胞相互聚集及血管壁的粘连中起重要作用。此部位也是MN血型抗原的携带区。如第一位是丝氨酸,第5位是甘氨酸是M型;第一位是亮氨酸、第5位是谷氨酸是N型。膜内区从72~100氨基酸与脂双层的PS及PI相连。伸向胞质的部分从101~131个氨基酸,功能还不清楚。
  2. GPB:分子量20kD。从基因结构分析,GPA含有7个外显子,除1,7不表达外,2到6都表达。GPB与GPA很相似,只是没有外显子3及6。
  3. GPE:分子量6kD,基因结构与GPA相似,只有外显子2及5,并在2,5之间插入一个小片段。
  4. GPC:分子量32kD,蛋白部分只有14kD,其他都是糖,有12个0-糖苷键,1个N-糖苷键。N-末端1~57位氨基酸,膜内区58~81位氨基酸,C末端82~128位氨基酸。在第48位处有Ge血型。
  5. GPD:分子量23kD,蛋白部分为11kD。有6个0-糖苷键,无N-糖苷键,从基因结构分析,GPC 有4个外显子,GPD比它少第1个外显子。

血型糖蛋白的命名及性质

血型糖蛋白的命名及性质

膜酶

红细胞膜的酶可分为两大类:一类位于膜上,胞质内不存在,如核苷酸代谢酶类(腺苷酸环化酶等)、糖代谢酶类、ATP酶(Na+,K+- ATP酶、Ca2+,Mg2+- ATP酶)、蛋白激酶及乙酰胆碱酯酶等;另一类在膜与胞质中均存在,如某些磷酸酶类(酸性磷酸酶、2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶等)、葡萄糖代谢酶类(3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶等)、谷胱甘肽代谢酶类(谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶)。以上两大类酶不能截然分开,由于处理红细胞的方法不同,可使酶失去本性,发生聚集或解聚,会得到不同的结果。

膜糖

红细胞膜上的糖类很多,有半乳糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖和唾液酸,含量较多的有乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸,这些糖多存在于伸展在膜外肽链上的多侧链糖链中,有多种功能,如抗原性(血型抗原参见下面)、受体反应、信息传递等均与糖蛋白的糖链有关。

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