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阵发性睡眠性血红蛋白尿症的发病机制

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的发病机制涉及不止一个因素。

基因突变引起异常细胞克隆的出现

PNH异常血细胞的共同特点是细胞膜表面缺乏一组膜蛋白,这种膜蛋白都通过糖肌醇磷脂(GPI)连接在膜上,统称糖肌醇磷脂锚连蛋白(GPI-AP)。所涉蛋白和GPI都在内质网形成,蛋白生成后旋即与GPI连接,然后转移到细胞膜外层。由于PNH细胞可以查到游离的这种蛋白和相应的mRNA,因此,可以推想PNH异常细胞缺少GPI连接蛋白不是由于不能生成蛋白而是因为不能生成GPI,所以这种蛋白就不能连接在膜上。GPI由脂质部分和核心结构组成,不同种类GPI的脂质部分差异很大,但核心结构均由1个肌醇磷脂、1个葡糖胺、3个甘露糖和1个乙醇胺按顺序相连构成,一头经肌醇磷脂上的2个脂肪酸(有的是3个)插入细胞膜脂质双层的外层,另一头由乙醇胺与蛋白相接。GPI生成的每一步都需一个关键酶。

1993年,日本学者率先报道了PNH的异常细胞缺少一种蛋白,这种蛋白的cDNA和基因核苷酸序列称pig-a基因,它是GPI生成第一步所需的一个关键的酶。用荧光原位杂交技术证明位于X染色体p22. 1部位。目前的研究表明,在所有已检测的PNH患者血细胞中,都发现有pig-a基因突变而导致GPI锚连蛋白的部分或全部缺失,说明pig-a基因突变在PNH发病中有重要作用。

PNH的pig-a基因突变为异质性,迄今已报道一百余种基因突变,广泛分布于多个编码区及剪接点,没有突变丛集区或热点。而且,主要以小突变为主,大的突变罕见。有典型溶血症状的PNH与AAPNH综合征相比,pig-a突变的基因图谱无明显不同。若同一患者有2种异常细胞(GPI连接蛋白全无或缺少),则可能源于2种突变产生的2种异常克隆。Luzzatto L于2000年分析了全球28篇报告的146例PNH患者的全部174个pig-a突变,其中135个(包括大段缺失、读框移位、无义突变)的后果将是pig-a基因产物完全失去活性,另一组中35个是错义突变、4个是小的框内缺失,其结果是pig-a基因产物部分功能缺失。前一组形成的细胞完全缺失GPI连接蛋白(相当于PNHⅢ型细胞),后一组形成的细胞部分缺失GPI连接蛋白(相当于PNHⅡ型细胞)。Norris等初步研究了pig-a基因突变位点的不同对PIG-A蛋白结构和功能的影响。作者分析了18例pig-a基因的错义突变,发现有6例位于编码子128~129和151~156上,这些编码子位于小鼠和酵母pig-a同源基因的高度保守的区域内,因此,猜想这些编码子可能编码PIG-A蛋白的关键部分。作者用点诱变的方法,获得具有这些编码子突变的pig-a的cDNA,分别转入原核及真核表达系统,测其PIG-A蛋白的结构及功能。结果表明,编码组氨酸128(H128)、丝氨酸129(S129)和丝氨酸155(S155)的编码子发生错义突变可导致PIG-A蛋白功能的部分丧失,而发生于编码侧链氨基酸残基的编码子的错义突变对PIG-A蛋白功能无影响。提示编码H128、S129和S155的编码子是影响PIG-A蛋白功能的关键部分。总而言之,PNH患者的pig-a突变部位遍布第2~6外显子整个编码区的多个位置,以及一些内含子之中,没有突变热点。第2外显子较长,突变发生部位也较多。

将正常的pig-a cDNA转入PNH异常细胞可纠正后者不表达GPI连接蛋白的缺陷,PNH可由于pig-a基因突变所致已能确定。涉及GPI生成全过程的基因至少有12个,涉及上述第一步的基因除pig-a外,尚有pig-cpig-h等。除pig-a外,也检测到了其他基因的突变,但PNH的发生是由pig-a突变所致。

异常细胞克隆的维持和扩增

p ig-a基因突变并不能解释异常克隆为何能扩增并占据优势。关于这方面的研究很多,曾一度为研究的热点,归纳为以下几点:

一、PNH异常克隆是在骨髓正常造血功能衰减的基础上才取得相对的生长优势。近年的体内外实验表明:PNH的异常克隆本身并无相对于正常细胞(这里指的是正常对照,而非病人正常表型的细胞)的增殖优势。2004年,美国Bessler等成功地建立了PNH的动物模型,发现具有pig-a基因突变的小鼠并无异常克隆的增殖优势,动物也未出现溶血、全贫及血栓形成的情况,说明单独的pig-a基因突变不是发病的唯一原因。值得注意的是,这些动物模型不具备常在患者中出现的潜在的骨髓衰竭及患者特有的造血微环境,提示除pig-a基因突变以外,可能还有其他因素才导致疾病的发生。

人们早就注意到PNH与AA的密切关系。早年研究发现PNH骨髓集落形成能力明显低于正常对照。近年来随着流式细胞技术的进步,对造血干细胞的研究进入了新的阶段。北京协和医院李强等(1997)、肖娟等(2000)、韩冰等(2000)分别在自己的工作中发现在PNH患者的骨髓的CD34+造血干/祖细胞比正常人少,而且其中CD59-细胞又比CD59+明显为多,提示PNH患者的正常造血干/祖细胞数量少,异常造血干/祖细胞在数量上占有相对优势。这些发现与近年的文献报道十分吻合。在再障、MDS患者,有相当一部分可检测出PNH异常细胞,对其进一步检测,可测出pig-a基因突变,提示这些疾病的内在联系。近年的一种观点是pig-a基因突变在正常人和不少情况下都可发生,如Araten DJ等(1999)发现多数正常人血中有缺少CD55及CD59的红细胞和中性粒细胞,数量分别为22/100万和8/100万,并且也可查出pig-a基因突变,但不发展为病。只有当正常造血功能衰竭时,才有可能发展为疾病。甚至认为必然有再障才会发生PNH,并且将注意力集中在自身免疫性再障上,提出正常造血细胞表面具有一些GPI锚连蛋白,可以成为能刺激细胞杀伤性细胞(如T淋巴细胞)的抗原或共刺激因子,从而被杀伤,而有pig-a基因突变的细胞由于缺失GPI锚连蛋白,因而可以逃避捕杀。

北京协和医院王毓洲等于2000~2001年的工作发现:PNH患者外周血中T8细胞/T4细胞比例增高,带有HLA-DR标志的活化的CD8淋巴细胞增多;γ干扰素和IL-2对CD34+CD59+的正常造血干/祖细胞有抑制作用。有人发现PNH患者中HLADR2的频率明显增高。在合并有骨髓衰竭的患者中,HLA-DR表达增高的患者免疫抑制治疗反应更好,说明免疫因素与PNH的发病、治疗反应有关。最近,日本学者在对PNH EL4细胞系的研究中,发现GPI+与GPI-细胞相比,对无论同种异体还是自身反应的CD4+T细胞的反应都更加敏感,证实一些锚连蛋白在T细胞识别靶细胞的过程中起着重要作用。体内实验也表明,给PNH患者进行同基因骨髓移植,假如没经过适当预处理,病情仅略改善后,仍将复发,如果采用包含环磷酰胺等细胞毒性药物的预处理方案,则可获长期缓解。上述研究为治疗提供了一定思路。但NIH曾对PNH患者单给予大剂量环磷酰胺,无同基因骨髓输注的治疗,这种治疗方法曾对再障有效,而对PNH患者当细胞水平恢复后,GPI+细胞比率无改变。同时还对PNH-AA患者进行传统的抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或环孢素(CsA)或两者合用方案治疗,可改善贫血状况,但不能使GPI+细胞比率提高。免疫抑制治疗无效的解释可能是:有多个免疫因素参与抑制骨髓造血,其中一个与GPI-AP表达相关。而ATG或CsA所逆转的免疫抑制可能与GPI-AP表达无关。

二、异常细胞本身具有一定的增殖优势。给经过亚致死量照射的严重联合免疫缺损症小鼠输注PNH患者或正常人的骨髓,7个月后,正常人骨髓消失,PNH患者骨髓仍存在。北京协和医院韩冰等2000年用流式细胞技术分选出PNH患者的CD34+ CD59+细胞与患者本人的CD34+CD59-细胞及正常人的CD34+CD59+细胞比较,结果不论是单个细胞培养还是群体细胞培养,在液体培养基中均显示:PNH患者的CD34+CD59-细胞的分裂、集落形成和扩增总数等均比本身的CD34+CD59+细胞为多,而两者又都比正常人的CD34+细胞为差。提示:PNH患者的早期造血细胞中表型异常者比表型正常者的增殖能力强,而两者都不如正常人的相应细胞,换言之,PNH的异常细胞对自身的正常细胞而言有一定的增殖优势,而患者的所谓正常细胞在增殖能力方面实际上不正常。2002年NIH的研究进一步证实了这一结论,并认为与异常细胞凋亡减少有关。1997年Brodsky RA等和Horikawa K等,分别报告PNH患者的异常血细胞有抵御凋亡的能力,从而用以解释异常细胞所占比例的增长。但是次年Ware RE等(1998)报告:有GPI锚连蛋白的中性粒细胞与缺乏GPI锚连蛋白的中性粒细胞凋亡率没有区别;将pig-a的cDNA导入PNH表型的B-淋巴细胞株,导入前与导入后细胞对Fas配体或X线诱导的凋亡没有差别,说明pig-a基因缺失与否不影响细胞凋亡。Bessler等2002年在PNH的动物模型中观察凋亡情况,发现PNH异常克隆与正常克隆相比,对凋亡剂的敏感性是相同的,说明单独的pig-a基因突变并不能引起异常克隆对凋亡的抵抗。

三、其他:除免疫因素外,患者血清、不同的生长因子是否对疾病发展产生影响,也是近年的研究课题。据王毓洲2001年观察:患者的CD59阳性或阴性淋巴细胞及其培养上清液对CD34+细胞的增殖无影响;据韩冰2000年观察PNH患者的骨髓成纤维细胞的集落形成能力正常,成纤维细胞的TNF-α、IL-6的mRNA表达也正常;2002年,韩冰等人在PNH的动物模型中观察集落刺激因子(G-CSF)的作用,并未发现其对异常克隆的显著扩增作用。虽然有人观察到,患者血清中EPO及G-CSF增高,IFN-γ正常,但是否与患者贫血,白细胞减少有关,还需进一步研究。

四、人们早就发现,在一些健康人也能检测到pig-a基因突变。这些在正常人中发生的突变为何没有导致PNH的发生?2007年,Brodsky等研究发现,正常人的pig-a基因突变是发生在较晚期的造血祖细胞上的,而PNH患者的突变是发生在多能造血干细胞水平。PNH患者的pig-a突变来源于多能造血干细胞(HSC),pig-a突变的HSC的扩增和分化导致临床疾病表现。而在大多数正常人,pig-a突变来源于集落形成细胞(CFC),CFC可以分化,但无自我更新能力,因此,这些pig-a突变不导致疾病。

综合近年的研究,无论患者的异常克隆还是其自身的正常克隆,与正常人的正常克隆相比,均存在生长劣势,提示潜在的骨髓衰竭因素;异常克隆相对于自身正常表型克隆又有一定增殖优势,但这种增殖不像肿瘤细胞那样无限制,而且并不随着疾病的发展而不断扩大。

总之,pig-a基因突变和骨髓正常造血细胞增殖功能衰减是PNH发病的两个重要因素,但是如何形成异常造血细胞与正常造血细胞生成和增殖的不均衡状态,异常细胞如何在数量上取得优势的机制依然不清。目前,主要有3个假说:①PNH细胞由于缺乏表面的GPI锚连蛋白,因此逃避了免疫攻击。②pig-a突变使得细胞对凋亡抵抗。③PNH克隆发生了第二次突变而产生了内在的生存优势。这些假说并非互相排斥。

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