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丙酮酸激酶分子结构与突变效应

PK同工酶与组织分布

丙酮酸激酶(PK)有四种同工酶,由两种不同的PK基因编码,位于染色体1q21的PKLR基因编码同工酶R(红细胞型)和L(肝型),位于染色体15q22的PKM基因编码同工酶M(肌型),M型又分为M1型和M2型,M2型主要分布在快速增殖组织和细胞中,可逐渐被其他形式同工酶取代。四种同工酶进行不同组合构成四聚体后,才具有PK催化活性。

在红系细胞,早期有核红细胞中存在M2和L两种结构基因,主要表达同工酶M2,随着细胞不断成熟,逐渐转向合成L型同工酶,幼红阶段和网织红细胞表达同工酶R1(四聚体L’4),成熟红细胞中为同工酶R2(四聚体L’2L2)。红系成熟和PK同工酶转变机制,类似于从胚胎合成HbF到合成成人HbA的调节机制。在遗传性PK缺乏症和继发性PK活力下降时,患者成熟红细胞可复又出现M2型同工酶,可能是一种代偿现象。这一现象可以被利用于对病程的分析,另一方面它也会对患者酶活力测定诊断产生干扰。

PK基因序列与酶蛋白高级结构

PK基因序列:编码红细胞型(R)和肝型(L)的PK基因PKLR有12个外显子,其中外显子1 为R型特异,外显子2为L型特异,R型和L型同工酶的编码取决于PKLR基因启动子上的组织特异性区域的差别。

PK酶蛋白高级结构:近年通过基因工程手段获得人红细胞PK结晶三维结构,对酶蛋白结构与功能的关系有了更深入的了解。哺乳动物PK结构中有68%的同源区域和相似的构型,可将PK单体亚基分为A、B、C、Nter四个结构区域,四个亚基聚合为空间构象完全镜像对称的四聚体,始具酶催化活性。

  1. A区:由第85~159、263~431位氨基酸组成,高度保守,由α螺旋与β折叠构成桶状结构;A区有底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和辅因子Mg2+、K+的结合位点。Arg116、Thr371、Gly338、Asp339是结合底物和辅因子的关键基团。
  2. B区:由第160~262位氨基酸组成,结构较为松散,可以旋转变构,插入A区,A区与B区空间构象相靠的界面构成酶催化活性中心。
  3. C区:由第432~574位氨基酸组成,平行的β折叠片层扭曲成马鞍形,在亚基之间形成盐桥,稳定PK四聚体。C区475-479环和557-566环有二磷酸果糖(FDP)结合位点,起变构调节作用。
  4. Nter区:为1~84位氨基酸组成的N末端小螺旋区域,细菌PK中不存在。Nter区的功能仍不明了。

PK基因突变型与临床表型的关联

PK基因突变型与临床表型

迄今已鉴定180种以上PKLR基因突变型,以错义突变为主(占69%),其他类型包括剪接突变(11%)、终止突变(5%)和小片段缺失、插入、移码突变(12%)。少见突变有大片段丢失,个别突变发生在红系特异启动子(-83G>C)。

从基因结构看,突变位点多在5,8,9,11外显子。从酶蛋白构象看,突变在氨基酸序列高度保守的A区疏水核心最多见,C区其次。除了氨基酸的保守性,突变后替代氨基酸残基的性质、对酶蛋白活性中心或对立体构象的影响作用都是导致临床表型差异的因素。

  1. 突变影响酶活性中心与底物或辅因子结合:主要为错义突变,如核苷酸G994A突变(Gly332Ser)位于A区疏水核心,导致酶活力下降9倍,热稳定性降低,临床溶血症状严重,需要定期输血治疗。
  2. 突变影响酶蛋白氢键缔合及构象折叠,降低酶的稳定结果性和(或)抑制酶的催化活性。错义突变为主,突变位点多见于各功能区域结合界面,特别是A区的A/C和A/A’界面、疏水区域中心。例如,A区407位突变(A 1220G,Glu407Gly)影响PK T型与R型别构转换。C区504位突变(核苷酸G1511T)影响与A区Asp281形成盐桥,造成酶蛋白极度不稳定,导致严重溶血。
  3. 突变影响变构调节位点:错义突变为主,如C区Arg532突变(核苷酸C1594 T)被Try取代后形成空间位阻,影响变构调节位点结合变构剂二磷酸果糖(FDP),对FBP调节效应完全没有反应,热稳定性也下降,患者临床症状严重。在C区Arg486Try(C1456T)突变中,色氨酸取代精氨酸后仍可以形成氢键,保持了空间结构保守性和变构反应,纯合子一般表现为轻度贫血。
  4. 突变影响酶蛋白结构完整性:与移码突变、剪接突变、无效突变等突变类型有关。例如移码突变644delG失去正常酶蛋白结构的80%,导致严重溶血性贫血。无效突变导致完全缺失功能活性酶蛋白,如在白种人常见的994A(Gly332Ser),表现为子宫内生长发育停滞、出生时严重贫血,依赖输血直至脾切除,少数病例宫内死亡或出生第一天死亡。

PK基因突变热点

从全球PK突变发生率来看,报告最多的有3种突变,分别为C1456T、C1468T和G1529A。PK基因突变具有种族和地区异质性,在180余种突变中,某些地区发生率高的突变为突变热点。如突变型G1529A最常见于美国人(占其突变型的42%)、北欧和中欧人(41%)。在南欧突变热点为C1456T,发生频率西班牙为32%、葡萄牙为35%、意大利为29%。突变型C1468T常见于亚裔;突变型G1511T在白种人和日本人均常见。以往报道印度次大陆常见突变型C884T和G943A,而印度本土报道常见突变为G1436A(19. 4%)、C1456/T(16. 7%)和A992G(16. 7%)。国内已报告3种突变G809C(Arg270Pro)、G1330T(Ala 443 Ser)、C1339 A(Leu446Ile),与文献突变类型和突变热点均不同。

PK基因多态性

PK基因多态性位点与一些致病突变类型有连锁不平衡的关系,因此受到关注。鉴定PK多态性,还有助于了解突变型人群分布、种族变迁和分子进化。

PK基因有8个多态性位点(-342T/A,-248T del,IVS5(+51)C/T,T10/19*,Microsatellite ATT,1705 A/C,1738 C/T,1992 C/T),三个在外显子12上,其余在启动子和内含子中。欧美人群中多见突变型G1529A伴有1705A/C多态性,日本人群中无1529突变,但有1151T突变、1261A突变伴1705A/C多态性,笔者测定中国人PK1705多态性,A、C、A/C几率分别为0. 22、0. 30、0. 48,与国外报道基本一致,中国人突变型中G1330T伴1705A/C多态性。

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