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再生障碍性贫血的发病机制研究

再障发病机制极为复杂,目前认为与以下几方面有关。

造血干细胞数量减少和内在缺陷

大量实验研究表明再障骨髓中造血干细胞数量明显减少,细胞集落形成能力显著降低。同基因骨髓造血干细胞移植仅补充正常造血干细胞,而不加任何其他预处理能使部分患者很快恢复正常造血功能,支持再障骨髓造血干细胞减少或有内在缺陷。再障患者骨髓造血干/祖细胞体外培养显示CFUGM、BFU-E、CFU-E、CFU-GEMM产率均明显减低,应用纯化的CD34+细胞进行培养其集落形成也仍是减低的,甚至加用高水平细胞集落生长因子其集落产率也不能明显增高。长期培养启动细胞(LTCIcs)可能代表真正的骨髓造血干细胞,研究表明在再障患者其数量明显减少,常低于正常的10%以下。若将骨髓造血细胞减少因素考虑在内,则再障患者骨髓造血干细胞数量减低更为明显,估计可能仅为正常人的1%左右。再障患者骨髓造血细胞进行性端粒缩短也提示造血干细胞数量有限,功能性衰竭。另外,经治疗恢复自身造血的再障,骨髓CD34+细胞数量仍明显低下。

除数量减少外,再障骨髓造血干/祖细胞本身还可能有缺陷。如,再障患者细胞DNA修复能力明显降低,用抗淋巴细胞球蛋白(ALG)治疗后仍不能纠正;部分经免疫抑制剂治疗有效的病例,在长期随访过程中演变为克隆性疾病,如阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征和急性非淋巴细胞白血病;部分再障骨髓呈克隆性造血,虽然这可能仅反映造血干细胞池的耗竭,并不意味着克隆性增殖;有部分临床和实验室检查典型的再障患者,骨髓造血细胞染色体检查可有克隆性细胞遗传学异常等。中国医学科学院血液病医院也曾经应用彗星实验方法证明:未经治疗的初诊再障患者骨髓造血细胞遗传不稳定性明显增高,支持再障骨髓造血干细胞可能有内在缺陷。

造血微环境支持功能缺陷

造血微环境包括基质细胞及其分泌的细胞因子,起支持造血细胞增殖及促进各种细胞生长发育的作用。通常,再障骨髓基质细胞功能正常,体外培养可支持正常CD34+细胞造血。目前尚无充分证据表明再障患者骨髓基质缺陷,但发现再障骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)和基质细胞产生的集落刺激活性(CSA)降低。中国医学科学院血液学研究所观察到再障骨髓基质细胞萎缩、脂肪化和CFUF减少,急性再障较慢性再障损伤更严重。多数体外试验表明,再障骨髓基质细胞生成造血生长因子(HGF)并无异常,再障患者血及尿中红细胞生成素(Epo)、粒-巨噬细胞系集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞系集落刺激因子(G-CSF)及巨噬细胞系集落刺激因子(M-CSF)水平增高;但再障患者IL-1生成减少。有研究证实再障患者造血干/祖细胞,尤其是BFU-E对Epo、Epo+IL-3及Epo+SCF反应性明显低于正常对照,甚至缺乏反应性。Wodnar-Filipowicz等检测了32例重型再障患者血清可溶性干细胞因子(SCF)水平,发现重型再障患者血清SCF水平低于正常对照者,但二者差异无显著性,血清SCF水平高者预后更好。如果再障是由于HGF缺乏所致,那么理论上HGF就可以治愈再障。事实上,大量临床治疗结果表明,HGF(包括SCF)只能一过性升高患者外周血细胞水平,并不能改变疾病的自然病程,部分患者对HGF治疗根本无效。异基因造血干细胞移植治疗再障,仅植入正常造血干细胞而骨髓基质细胞仍为患者起源,可有效重建造血,支持再障骨髓基质细胞可能并无明显异常。

异常免疫反应损伤造血干细胞

再障患者经免疫抑制治疗后其自身造血功能可能得到改善,此为异常免疫反应损伤造血干细胞最直接的证据。异基因骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)治疗重型再障需用免疫抑制剂作预处理才能植活。大量体外实验证明,再障患者T淋巴细胞(主要是CD8+T细胞亚群)与造血功能衰竭密切相关,在急性再障T淋巴细胞常被激活,可抑制自身及异体祖细胞集落形成。Zoumbos等证明,再障患者T4/T8比例倒置,T8细胞活性增加,这种细胞在体外有抑制造血和释放抑制因子的作用。Gascon测定15例再障Tac+细胞,其中11例增高,Tac抗原表达增高提示患者淋巴细胞亚群处于“预激活状态”。Mentzel等分析9例再障患者,发现γδ-T细胞亚群表达δTCS1表型明显增加。Blustone等认为γδ-T细胞尤其是δTCS1-T细胞增高可能对造血起抑制作用。再障患者血清干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素2(IL-2)等造血负调控因子水平多增高。患者骨髓细胞中IFN-γ基因表达增强,个别再障患者体内可检测到抑制自身造血祖细胞生长的抗体,干细胞抑制因子(SCI)RNA转录水平显著增高。Plantanias等发现,对免疫治疗有效的再障患者,体内IFN-γ明显减少,体外以抗体中和内源性IFN-γ或IFN-α后可使患者骨髓CFU-GM产率成倍恢复。登革热病毒感染后释放IFN-γ,引起淋巴毒反应,使干细胞受损而出现再障。Shinjinakai等用PCR检测23例再障单个核细胞中细胞抑制因子的基因表达,发现IFN-γ mRNA在再障患者中有明显表达,且与输血无关。转化生长因子(TGF-β)是生理性造血负调节的核心因子,对造血前体细胞起可逆性的抑制作用,其特点是选择性地抑制依赖IL-3、GM-CSF、IL-6和IL-9等造血因子的造血前体细胞的增殖和分化。近年来认识到许多白细胞介素参与造血过程,有的起CSF辅助因子的作用,有的则本身有集落刺激因子活性。Nakao等检测17例再障,发现10例IL-1显著减少,其中9例为重型再障。部分再障患者IL-2显著增加,部分患者IL-3(SCF)明显减少。自然杀伤细胞(NK)可以抑制较成熟的造血祖细胞集落生长,人体NK细胞还具有产生IL-2、IFN-γ、IL-1及CSF等多种淋巴因子的能力。Yashhiro等检测12例再障患者外周血,其NK细胞活性减低。

上述的免疫异常多在已呈典型表现的再障患者研究获得,包括T淋巴细胞活化、细胞因子释放和特异性靶细胞损害等,属晚期免疫事件,是自身免疫性疾病的共同特点,并非再障所特有。在骨髓造血干祖细胞广泛损伤之前机体如何发生免疫异常,也就是再障早期免疫事件及其特征并不清楚。

近年研究为再障免疫发病机制提供了更多的证据。Maciejewski等应用TCR-Vβ-CDR3高分辨率分析法研究TCRβ链可变区CDR3多态性发现,再障患者,尤其带有HLA-DR2或HLA-A2分子者,其Vβ-CDR3类型偏颇的比率和程度明显高于健康人和多次输血者;在单细胞水平进行TCR-Vβ序列分析,证实大部分再障患者较正常对照组,表达高度限制性的TCR库;对CD4+、CD8+T细胞亚群分别进行分析,发现CD4+T细胞Vβ链倾向于多克隆性表达,而CD8+T细胞Vβ-CDR3表现出明显的偏颇性;免疫抑制治疗有效的患者,其CDR3偏颇程度较治疗前减低;在环孢素治疗依赖性的再障患者中,检测到明显偏颇的CDR3类型,这些均提示再障患者存在细胞毒T淋巴细胞反应,并且与骨髓造血衰竭的发生有关。T-bet是一种转录因子,可直接结合于IFN-γ启动子的近端,激活IFN-γ基因转录。较于正常对照,再障患者T细胞中T-bet水平增高,IFN-γ表达上调。对再障患者骨髓CD34+造血干细胞基因表达谱分析显示,凋亡/细胞死亡相关基因、负性增殖调控基因和防御/免疫应答基因表达较正常对照组明显增加。利用IFN-γ诱导正常CD34+造血细胞,发现其基因表达谱与再障患者CD34+细胞基因表达谱相似。另外,再障患者常伴有调解性T淋巴细胞数量减少和功能异常,这些结果进一步支持免疫损伤在再障发病过程中的重要作用。

通过人类胎肝或白血病细胞系cDNA文库表达蛋白与再障患者血清进行反应,利用抗原特异性的自身抗体作为代替标记物筛查出数个再障T细胞作用的潜在靶抗原,提示移动素结合蛋白(kinectin)、PMS-1、DRS-1和膜突蛋白(moesin)均可能是再障异常免疫反应相关的自身抗原。但是,这四种抗原在再障患者中的表达率仅分别为10%~39%,更为重要的是这些抗原不仅表达于造血干/祖细胞,同时也表达于其他的组织细胞,目前不能解释为何仅在骨髓中诱导异常的免疫反应损伤造血干/祖细胞,而无其他组织器官受损表现。经亚致死量照射的小鼠输注母系淋巴细胞后可以制造再障模型,考虑始动因素诱导特异性T细胞免疫应答,活化的CTL在骨髓局部分泌高浓度的细胞因子如IFN-γ和TNF-α,损伤造血干/祖细胞,从而导致再障发生,即无辜旁观者造血干细胞损伤机制。提示再障自身抗原可能并不完全限于造血干细胞所特有的抗原决定簇。

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