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中性粒细胞的凋亡

细胞周转的重要性已为白细胞生物学者所熟知,绝大多数造血系统的细胞寿命都很短促,从外周血的中性粒细胞不到1天的寿命,到单核细胞、淋巴细胞有几周或几个月的生存期,但与神经细胞相比,血细胞的寿命是极其短暂的。已熟知造血作用并非总是以极高速率产生新细胞的,而且细胞的生成必须与其凋亡相适应以达到机体平衡自调节。从这点考虑,细胞的凋亡与细胞的生成和分化是同样重要的,是细胞生命的基本特征之一。现已进一步认识到细胞增殖和凋亡两过程间的协调对维持机体稳定和防止肿瘤发生具有重要意义。

程序性细胞死亡和细胞凋亡概念

程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)首先由Lockshin和Williams(1964)在描述昆虫生活时提出。虽然以后的一些著作中常把PCD、生理性死亡和细胞凋亡看作含义相同,它们都不同于细胞坏死,即不伴有炎症和细胞崩溃及内含物释放,都是由基因指导的细胞自我消亡。但如果把彼此等同起来,又未免简单化了,因为每个术语有其特殊的含义,具有明确的生物学功能,在应用时还需与具体情况相结合。PCD是对发育时期中功能关系的程序化过程下的定义,往往与基因程序相关联,程序性过程不可能是随机过程。PCD在时间和空间上均能精确测定,而且是一种细胞内在的独立进程。在机体需要时,细胞内部有“自杀”能力,其发生受基因控制,并受一定的迄今未明的因素触发。例如,大部分淋巴细胞在成熟前即死亡,但未有特殊性,也不预示整个群体死亡。与细胞凋亡相比,虽然PCD也有核固缩和胞质缩合等细胞凋亡呈现的现象,但已发现二者有不同的特征;如PCD有溶酶体的增加而无DNA梯状图谱,在蛋白质合成方面除总的合成下降外,还需有新蛋白合成。近年研究PCD时的转录作用,提出更令人信服的结果,即原来活跃的基因停止转录,而另一些基因的转录则增加,包括c-mys、c-fos 及hsp70等。

细胞凋亡最早由Kerr(1971)提出,他借用希腊古典派作家Hippocratic文集中“apoptosis”一词,意为花瓣凋落或秋天树叶凋落。

细胞凋亡是对一种细胞死亡所呈现的形态和生化特征的描述,细胞通常只通过有限的方式自然死亡,最终都要进入细胞凋亡这一共同途径,但凋亡并不一定包括程序化方式。

在一些高度特化的细胞中,要想从形态上辨别其是否凋亡是非常困难的,即使已有一些生化证据证明某细胞是经凋亡死亡的,例如皮肤的角质细胞等。尽管有这些困难,但经过多年的研究,对细胞凋亡的形态学特征和生化特征已有了归纳,以区别于细胞坏死,这无疑推动了细胞凋亡研究的深入。

细胞凋亡的形态和生化特征

细胞凋亡是细胞的基本特征之一。经多年研究,已将其在形态上和生化上的共性作了大致归纳。

(一)细胞膜:形成有柄突起(起泡),凋亡细胞很易被周围细胞迅速吞噬,表明细胞膜有了一定变化易被巨噬细胞等识别。已报道有一种属于细胞黏附素家族的一个异原体玻连蛋白的受体与此有关。但膜仍保持完整性,无细胞内含物泄漏。对早期凋亡细胞的研究表明,质膜脂双层的磷脂在内、外层之间发生易位,起泡可能与此有关。

(二)细胞质:凝缩形成空泡,核酸内切酶被激活,溶酶体变化不大。

(三)细胞核:染色质聚集、分块和萎缩,这是细胞凋亡的主要标志,同时染色质发生有控降解。现知这过程分2步进行;首先由核酸内切酶把DNA切割为300~50 000bp范围的片段。DNA被分割到这种程度已超出能修复的范围。究竟哪些酶类参加尚未鉴别。某些细胞但不是所有细胞中,细胞凋亡时,DNA双链在核小体联结子部位断裂,因而其凝胶电泳呈现梯形图谱。第2步,产生的片段和核小体,其最终分割可能是由多种不同酶作用的结果。初步证明DNA毁坏使转录终止,导致细胞死亡。

(四)代谢方面:细胞凋亡的另一个特征是有新的蛋白质合成。合成的新蛋白可能在促进细胞凋亡或延缓细胞凋亡两方面起作用。所以新蛋白的合成一方面证明细胞凋亡是一种主动性过程,也表明它只是在某些情况下为启动凋亡所需,而不是完成细胞凋亡全过程的必要条件。目前的研究结果发现,许多类型细胞在发生凋亡时很早就有胞质内Ca2+浓度持续增高现象,Ca2+增高可激活钙依存性酶,进而使DNA断裂和胞质蛋白交联,并破坏细胞骨架。

虽然对细胞凋亡的形态和生化特征作了初步归纳,但还有许多疑点尚未解决:①细胞凋亡虽然是一系列正常变化“错位”的结果,但仍不知道是否存在一种信号触发细胞进入凋亡途径,以及该途径是否在任何水平上均能导致细胞凋亡。事实上,迄今尚不知道是否存在凋亡信息途径。②一些所观察到的凋亡细胞的许多特征性变化,很大程度上还难以判定是凋亡发生的原因还是凋亡引起的结果。例如一个受损伤的细胞有可能死亡,也可能进行修复而存活,这要取决于哪种倾向占优势。③许多研究细胞凋亡的实验大多是在体外培养条件下进行的,与体内明显不同的是发生凋亡的细胞不能被及时清除,更重要的是需了解发生凋亡时并非所有细胞都一样。因为某些细胞可能处在繁殖期,而另一些则处在G0期,因而没有理由认为静息细胞引起凋亡的变化恰好就是增殖所需的变化,而且那种认为在某一细胞株中获得的实验结果就是所有细胞的真实结果显然是错误的。

细胞凋亡的基因调节

细胞凋亡变化在不同类型细胞中的相似性和对各不同类型触发反应的相似性表明,细胞凋亡是一有序进程,也即存在一个控制程序性细胞死亡的细胞死亡程序。虽然触动细胞程序性死亡的基因还未确定,但已有一些可喜的结果。初步证明ced- 3ced-4是导致细胞程序性死亡的基本基因。Yuan等(1993)发现华美新杆线虫(C. elegans,希文一注)发育中的131个细胞因这两种基因发生点突变而正常存活。ced-4的产物是一种钙-结合蛋白,ced- 3的产物是一种半胱氨酸蛋白酶。ced- 3编码的这种产物在哺乳动物中的同源物是IL- 1β转化酶(ICE)。Squier(1994年)等报告了钙依存性半胱氨酸蛋白酶钙依蛋白在哺乳动物细胞凋亡中的重要性。目前对ced-4ced- 3类似物的研究正引起巨大兴趣。另一些基因,如从未成熟胸腺细胞中分离的RP- 2RP-8,由于在细胞凋亡进程中表达增加也被认为与凋亡相关联。此外,从前列腺细胞中分离的TRPM- 2、SGP- 2和成簇蛋白(clusterin)、组织谷胱甘肽转移酶基因,发现与某些特殊类型的细胞死亡有关。但这些基因的表达究竟是因还是果仍有待鉴别。

令人感兴趣的是,已发现某些基因对细胞凋亡有抑制作用。如定位于染色体180,21的原癌基因bcl- 2,现被称作细胞凋亡抑制基因,对细胞凋亡有直接调节作用。所有造血细胞和淋巴细胞都含有bcl-2蛋白。用电离辐射诱导细胞凋亡的研究结果,提示bcl- 2可能通过抑制氧自由基对脂的氧化而发挥其抑制细胞凋亡功能。虽然其在生物学方面的重要性仍有待确定,但它的发现无疑给肿瘤研究带来突破。大量表达bcl- 2蛋白的细胞能抵抗若干化疗剂,说明这是一个很好的多药耐药模型。令人深思的是bcl- 2ced- 9同源。ced- 9是华美新杆线虫的基因,也有拮抗细胞凋亡的性质。在感染的细胞中也发现有些病毒中存在拮抗细胞凋亡的基因。这使人得到启发:如果一个体细胞为病毒所侵染,则该细胞迅速自杀性死亡以抑制感染扩散,而病毒则以通过抑制细胞凋亡的基因来阻止细胞的自杀以使自身繁殖。从这点出发,我们可以认定所有顽固持续感染的细胞是机体的真正不利因素。

细胞凋亡功能的抑制将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常,而细胞凋亡功能的亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关。

bcl- 2是细胞凋亡过程中的一类调节基因,此基因家族包括两类功能相反的基因,一类是抑制细胞凋亡的基因bcl- 2bcl- x2bcl- wbfl- 1等,另一类是促进细胞凋亡的基因baxbakbcl- x3bad等。

许多bcl- 2相关蛋白和Bax主要位于线粒体膜内侧,bcl- 2还分布于核膜和内质网。Bax是一个可溶性蛋白分子,主要位于胞质中,但当凋亡发生时,它从胞质移位到线粒体并与线粒体膜结合。研究显示bcl- 2相关蛋白必须定位于线粒体才能发挥其调节凋亡的作用。bcl- 2将蛋白激酶Raf- 1定位于线粒体,bcl- x2将线虫的死亡调节基因Ced-4及其同源蛋白定位于细胞胞质的生物膜上,从而阻止其进入细胞核诱导凋亡的发生。bcl- x2可通过Ced-4与某些半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶(caspases)作用,将其结合于线粒体膜上,使之脱离存在于胞膜和胞质中的作用位点。caspases是诱导凋亡的关键酶。

bcl- 2家族中抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例,决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。研究表明,在细胞凋亡的调节中,bcl- 2家族成员间通过相互的纯或杂二聚体作用形成动态平衡。

人成熟的中性粒细胞的自发性凋亡一般在几小时至数天内发生,这是这些细胞在循环中具有高度更新能力的象征。循环中性粒细胞的生活期与其他白细胞相比短促得多,但其生活期则通过加快或推迟而缩短或延长。凋亡出现时,中性粒细胞的质膜仍然是完整的,因而可以防止这些细胞的促炎性和有组织毒性内容物的释放。但凋亡毕竟也导致中性粒细胞反应性的降低,而使巨噬细胞对其特异性识别而清除,中性粒细胞凋亡的发生或防止是近年研究炎症控制的核心事件。

多种炎性细胞因子均可通过调节细胞凋亡而影响中性粒细胞的存活期。GM- CSF抑制中性粒细胞是众所周知的事实。其他如TNF-α能促进凋亡,中性粒细胞募集到达炎症部位,并通过CD11b/CD18分子的黏附作用,也能促使迁移细胞的凋亡,这种对迁移中性粒细胞的安全清除也许有利于减退该处的炎症反应。

虽然中性粒细胞是体内平衡及炎症进程控制的核心环节,但控制中性粒细胞凋亡的分子机制远未清楚。曾有报告指出,激活的Src激酶家族成员Lyn可能参与GM- CSF介导的中性粒细胞凋亡的推迟作用。因为在中性粒细胞中发现缺乏凋亡相关基因bcl- 2家族,因而研究者宣称这种在多种细胞中对凋亡起关键控制作用的基因可能不参与中性粒细胞凋亡的调节。但是在转bcl- 2基因的小鼠中发现因抑制凋亡而使中性粒细胞存活期延长,这证明了bcl- 2蛋白的靶物质是存在于中性粒细胞上的。

哺乳动物凋亡相关蛋白bcl- 2家族由抑制凋亡的(bcl- 2、bcl- X1、Mcl- 1和A1等)成员和促进凋亡的成员(Bax、Bak、Bad、bcl- x5和Bik等)组成,而且促凋亡和抗凋亡间的平衡情况决定各种体系细胞的生活期长短。bcl- 2拮抗细胞凋亡的方式和该家族的其他成员一样是通过形成同源二聚体(homodimer)或是异源二聚体实现的。升调节抗凋亡bcl- 2或其深度同源物bcl- X1即可拮抗凋亡。而降调节bcl- 2或使其与Bax-α形成二聚体拮抗即可促进凋亡。bcl- 2家族调节凋亡例如通过控制caspases的活性,经由从线粒体释放细胞色素C调节凋亡。虽然对人中性粒细胞凋亡过程中的caspases- 3(CPP32)活性已经确认,但还未有关于控制该蛋白酶的分子的有关信息。Pamela Weinmann (1999)等用RT- PCR技术发现循环中性粒细胞中表达有凋亡相关基因bcl- 2家族成员bcl- x1bax-αbak,但不表达bcl- 2,但在髓细胞株HL-60中却发现有bcl- 2 mRNA,用细胞因子可以影响这些基因的相应产物:在用TNF-α促进凋亡时发现抗凋亡蛋白bcl- X1的表达降低,而在用GM- CSF防止凋亡出现时,发现死亡始动蛋白Bax- A的表达被降调节,而且发现细胞因子可影响Bax-α/bcl- X1表达的比例并调节下游的caspases- 3的活性。并通过正反馈(positive feed- forward)机制降调节bcl- X1而启动凋亡。

中性粒细胞的凋亡、功能变化及清除

1989年Savill等首次报告了人髓性细胞的凋亡或生理性死亡。此前人们对正常组织中和解除炎症的部位中的中性粒细胞消失所知甚少。在正常条件下,每天大量产生的中性粒细胞与组织中消失和死亡的数量相平衡,老化的中性粒细胞典型的死亡方式是凋亡,它在凋亡之后,随即为巨噬细胞清除掉。在脓肿或急性炎症部位,中性粒细胞的死亡方式是坏死崩溃,产生脓液和组织坏死。对体外周血的老化中性粒细胞的观察表明,其具有典型的凋亡性形态学特征:细胞萎缩、细胞质空化、核浓缩断裂,但胞质细胞器和颗粒膜完好,而原有功能如丧失趋化性、对刺激反应的变形性、吞噬功能、脱颗粒作用及呼吸暴发作用等均明显下降。清除组织中和炎症部位无用的细胞,又不使中性粒细胞有害的内含物泄漏的工作主要由巨噬细胞承担。把人外周血中性粒细胞置于组织培养介质中培养,观察到随着时间的推移细胞凋亡性状越明显,而且巨噬细胞对该细胞的识别、吞噬消化的程度与该细胞凋亡的严重程度相关联。巨噬细胞是专司吞噬的细胞,此外,邻近的内皮细胞甚至肿瘤细胞也参与清除工作。

识别已有凋亡性质的老化细胞可能包括多种蛋白质参与和一些机械作用。如果由于某种原因造成清除的缺陷可能会导致疾病,例如可导致核降解物在免疫系统中过多积累而引起自身免疫性反应。因而清除废细胞的工作是一种高效的、有重要意义的保护性功能。

巨噬细胞吞噬、消化凋亡细胞并不需要激活自身,这点已通过测定当时的巨噬细胞中只有少量N-乙酰- 2- D-氨基葡萄糖苷酶,而且没有释放前期炎性物凝血噁烷A2而得到证实。已有几种假设以说明吞噬细胞识别凋亡细胞的机制。发现用一种尚未鉴定的吞噬细胞凝血素作用于凋亡细胞表面糖链分子可以促进细胞识别。在培养的新生仔鼠肝细胞中发现,凋亡细胞表面糖链末端的唾液酸有丢失。Savill (1993)等更提出吞噬细胞对凋亡细胞识别是由于其对荷电分子和pH变化敏感,正是这点导致发现了巨噬细胞依靠黏附性糖蛋白TSP在αvβ3异二聚体玻璃连接蛋白受体与CD36之间架设分子桥,而实现对凋亡细胞的识别。进一步分析表明,TSP可能结合在凋亡细胞表面,而且位于巨噬细胞表面的TSP、CD36和αvβ3的作用对识别作用是必需的。

另一些证据表明,巨噬细胞对凋亡细胞的识别可能与凋亡细胞质膜失去正常的不对称性有关。不对称性的丧失可能增加了磷脂酰丝氨酸的暴露,导致巨噬细胞上的磷脂酰丝氨酸特异性受体对其识别。此外,较一致的认识肯定了微环境信息因素在识别中的重要性。

对中性粒细胞体外研究的结果已证明,许多因子对中性粒细胞的凋亡的影响差异性甚大,有的有抑制作用,有的有诱导作用,有的则没有影响。Colotta(1995)等证明,中性粒细胞与炎性细胞因子IL- 1β、TNF、IL-6、γ-干扰素、G- CSF和GM- CSF、LPS或钝化的链球菌等共温育后可以延长生存期,并指出保温48小时后的细胞通过形态学和DNA片段检测发现,具凋亡特征的细胞数减少。但典型的趋化因子FMLP、C5a和IL- 8则对中性粒细胞存活没有影响。另一些研究在G- CSF、GM- CSF和LPS实验中取得了相似的结果。但另一些研究结果却持异议。如Haslett(1992)等报告了经C5a和FMLP处理的细胞其凋亡率明显降低。更有人指出,IL-6的作用,不同研究者的结果可以大相径庭。研究工作的不一致,说明对用不同方法测定的结果进行比较是困难的,这也可能与供血者和培养介质的质量差异有关。尽管如此,有一点是清楚的,即中性粒细胞的凋亡过程能被多种细胞因子所调节。

炎症是一个受到精细调节的过程,它包括入侵病原体或损坏组织细胞的排除和宿主组织的修复和重建。随着胞外基质的短暂重建,在对组织损伤的反应过程中有几个变化是平行出现的:产生趋化因子(chemokines)、细胞因子和生长因子。

这就引发修复进程和最终使炎症反应消除。从循环中募集炎性细胞(主要是中性粒细胞)。巨噬细胞从炎症部位清除凋亡细胞和细胞的脱整合作用或坏死间平衡的微扰即可决定炎症可否最终被消除。中性粒细胞通过坏死的死亡导致毒性颗粒内容物的释放,使正常细胞遭受损伤,因而加重炎症进程。反之,中性粒细胞的凋亡性死亡可避免这种组织损伤。凋亡作用与中性粒细胞的功能性分离有关,这可限制对细胞外环境中促炎信息的反应。此外,质膜表面的变化使巨噬细胞对其易于识别并清除。巨噬细胞对凋亡细胞吞噬性的清除是与Fc受体介导的吞噬作用不同的机制。其并不引起巨噬细胞释放促炎介质(如凝血噁烷B2),而进一步限制了对组织损伤的潜在威胁。

一些因子可影响凋亡中性粒细胞的组织泊定,炎性介质和生长因子通过抑制髓性细胞亚群中的凋亡比例而可延长这些细胞的生存期。在炎症部位的凋亡比例的变化能调节中性粒细胞的数量,这有利于巨噬细胞对其识别,因而减少中性粒细胞对组织造成损伤。在治疗策略上注重在对调节机制的把握,以利于限制炎症期的不利影响。然而若对凋亡细胞的吞噬性清除过度,则凋亡性细胞就“二次坏死”,而引起组织损坏,并因此而导致出现慢性炎症。巨噬细胞识别、吞噬作用和自炎性部位清除凋亡细胞的调节机制是其基础,也是注重的中心和炎症消除的核心问题。

McCutcheon指出巨噬细胞胞外基质环境可提供一种信号,简捷地、迅速地改变巨噬细胞对凋亡细胞的清除能力和炎症的消除过程。

中性粒细胞到达炎症部位后,其程序性凋亡可被宿主和细菌两种因素延迟,中性粒细胞这种延长生命的方式对保持其杀死病原体的功能有重要意义。中性粒细胞遇到病原体时,首先从血管中逸出而汇集至炎症部位。因其陷于各种细胞因子和因整合蛋白介导的信号传递而处于一种始动状态。始动状态是一种调节炎症最基本的控制点,此时有两个主要影响:①蓄积足够的能力与病原体作用并将其杀灭;②指令推迟凋亡以延长其功能生命。这两点对病原体的防御是明显有益的。

到达炎症部位的中性粒细胞迅速清除病原体,此后即进入凋亡。炎症期间中性粒细胞凋亡有助于炎症的消除,促使巨噬细胞清除,同时可以保护宿主组织免受中性粒细胞介导的损伤,引导的免疫反应如果过度,会损伤宿主防御,因此以凋亡方式适当地调控中性粒细胞的生命周期对宿主而言有良好的结果。然而,病原体的进化会以各种方式逃避免疫反应和清除,这些机制是复杂而多样的。病原体往往选择不被中性粒细胞清除而坚持下去,然而在操控上,中性粒细胞凋亡是提高识别免疫逃避的关键模式,改变中性粒细胞死亡的周期和模式获得更多的发病机制知识,将能够衔接被干扰的进程和宿主的失衡。

(法祥光)

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