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器官微环境与耐药

恶性肿瘤的转移灶和治疗后残留灶的复发是肿瘤患者的主要死因,也是肿瘤治疗所面临的主要困难和挑战。造成这种困难的原因主要有两方面:①恶性肿瘤具有生物异质性,是由具有不同生物特性的细胞亚群组成的生物异质体;②不同的宿主因素及体内条件的存在。以往的研究及肿瘤治疗手段更多的聚焦于前者,而往往容易忽略了宿主因素,特别是肿瘤细胞所处的特殊微环境的作用。而实际上正是特殊的宿主微环境提供了肿瘤细胞生存和增殖的土壤,特别是肿瘤细胞外基质(ECM)细胞(主要包括巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞)及其分泌的多种因子的作用日益受到重视。肿瘤细胞其所处的宿主微环境之间相互作用,形成内稳态,通过多种途径影响着肿瘤细胞的生物学特性,宿主微环境对肿瘤细胞的耐药表型及血管新生的影响是其中最为重要的途径。通过研究它们之间的相互作用机制,可能为攻克恶性肿瘤,特别是耐药的难治性肿瘤提供新的诊断治疗手段。

宿主微环境与肿瘤细胞多药耐药的关系

在所有正常人类组织中均可检测到Pgp及mdr1基因的mRNA,但是不同器官中的Pgp及mdr1基因mRNA的水平相差很大,在肾脏、肝、消化道和肺等器官Pgp及mdr1基因mRNA的水平较高,而在睾丸、卵巢、子宫和皮肤等器官处于较低水平。即使在同一器官的不同细胞,Pgp及mdr1基因mRNA的水平也有很大差异,而且Pgp在细胞膜的分布并不均一。例如在肝脏,肝细胞的Pgp及mdr1基因mRNA的水平远低于胆管上皮细胞。Pgp在肝细胞的分布则集中于胆小管一侧。这些差异表明在不同的器官组织中存在着特定机制调控mdr1基因的表达。

正常情况下即有Pgp高表达的器官、组织所发生的恶性肿瘤,常常在接触化疗前即对多种化疗药产生耐药(即内在性的多药耐药)。在这类肿瘤中Pgp及mdr1基因mRNA的水平不仅与肿瘤耐药的程度密切相关,而且与肿瘤的侵袭和转移等生物学特性相关。而恶性肿瘤在这些器官形成的转移灶也易产生与Pgp相关的多药耐药现象。值得引起重视的是,这种耐药的恶性肿瘤无论是原发灶还是转移灶一旦离开特定的器官微环境后,肿瘤细胞Pgp的表达水平及其对化疗药物的敏感性均会发生变化。提示特定的器官微环境通过与肿瘤细胞间的相互作用调节mdr1基因的表达,进而影响肿瘤细胞对化疗药物的反应。

以敏感细胞KB-3-1为对照研究了mdr1基因在胃癌和结肠癌的表达为例。大多数的结肠癌和半数胃癌细胞mdr1基因mRNA的水平高于敏感细胞KB-3-1,而且Pgp的表达水平与肿瘤细胞的分化程度相关(分化程度越高则mdr1基因mRNA的水平越高)。肿瘤周围的正常组织细胞中mdr1基因mRNA的水平也较高(与肿瘤细胞之间并没有明显差异)。但是当这种结肠癌或胃癌细胞作为异种移植物移植于裸鼠体内后,mdr1基因mRNA的水平明显低于敏感细胞KB-3-1,且与细胞的分化程度不再相关。而肿瘤的基质细胞,例如鼠成纤维细胞mdr1基因的mRNA的水平极低。由此可见mdr1基因的表达是暂时的,一旦离开了特定的器官微环境,mdr1基因的表达会随之下降,进而使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性发生改变。

利用乳清酸诱发的小鼠肝癌模型进行研究,可发现Pgp的表达水平与肝癌的恶性进展过程相关,由此可将肝癌的进展过程分为四个时期:显微性损伤、增生的肝结节、肝细胞癌和肺转移。Pgp在增生的肝结节及肝细胞癌的表达水平明显高于显微性损伤期。在肺转移灶,Pgp的表达水平也较高,这可能存在着两方面的原因:①Pgp的表达水平与肝癌细胞的转移特性密切相关;②肺部的微环境诱导转移灶肝癌细胞mdr1基因的表达。有的研究也发现在许多侵袭性肿瘤的边缘Pgp的高表达,提示Pgp与肿瘤的侵袭转移的生物学特性相关。

用鼠CT-26结肠癌细胞,分别建立了肺及皮下转移灶,可以观察到皮下转移灶对阿霉素敏感,而阿霉素对肺转移灶的作用极小。CT-26结肠癌细胞对阿霉素的敏感性与mdr1基因mRNA的水平直接相关。与原代或来源于皮下转移灶的CT-26相比,来源于肺部转移灶的CT-26细胞对ADR耐药,且有较高水平的mdr1基因的表达。这种耐药性可被维拉帕米所逆转。将来源于肺部转移灶的CT-26细胞植入裸鼠皮下后,原来耐药的CT-26对阿霉素的敏感性明显提高,mdr1基因mRNA及Pgp的水平也同时下降。而来源于皮下的CT-26细胞经静脉接种在肺实质形成转移灶后,原来敏感的CT-26细胞对阿霉素耐药,mdr1基因mRNA及Pgp的水平也同时上升。这就排除了mdr1基因表达水平不同的细胞亚群对实验的影响,进一步证明了肺部特定的器官微环境是提高CT-26结肠癌细胞mdr1基因表达水平的原因。一旦离开这一微环境(体外培养7天后),CT-26细胞mdr1基因的表达水平及对阿霉素的敏感性基本与原代敏感细胞相同。利用鼠UV-2237纤维瘤、人KM-12结肠癌细胞及鼠B-16黑色素瘤细胞进行的一系列实验均得到了类似的实验结果,即皮下转移灶的肿瘤细胞对阿霉素的敏感性高,而肺或肝转移灶的肿瘤细胞对阿霉素的敏感性低。而且肿瘤细胞的耐药程度直接与mdr1基因及其Pgp的水平相关。Pgp的表达是暂时的,离开特定的器官微环境后,耐药肿瘤细胞mdr1基因mRNA和Pgp的水平及对阿霉素的敏感性与原代敏感细胞相同。这些实验证明特定的器官微环境可以诱导肿瘤细胞产生与Pgp相关的多药耐药现象。

在体外实验中,通过与某些化疗药物的接触可改变肿瘤细胞mdr1基因的表达,使肿瘤细胞产生与Pgp相关的多药耐药现象。而以上临床及实验结果证明,特定器官微环境可以影响恶性肿瘤细胞(原发灶或转移灶)的耐药表型。提示在体内,调节正常组织mdr1基因表达的器官特异性因子,可能为肿瘤细胞(原发灶或转移灶)mdr1基因表达水平的决定因素。

白血病细胞对药物的敏感性同样受到微环境的影响,中国医学科学院血液学研究所在残留白血病耐药再生长的实验研究中发现,在骨髓基质细胞黏附层形成前50ng/ml的柔红霉素即可将培养的白血病细胞全部杀死;而当骨髓基质细胞黏附层形成后,加入50~100ng/ml的柔红霉素均不能杀死全部白血病细胞。药物摄取实验结果显示黏附层中的白血病细胞比悬浮的白血病细胞摄取的柔红霉素少。说明一部分白血病细胞在基质层中获得了耐药能力。正常骨髓中造血干细胞的生存和增殖分化严格受控于以基质细胞为核心的造血微环境的调节。白血病细胞虽然是失控的恶性细胞群,但体外培养实验证明它们的增殖依然需要细胞因子的刺激,骨髓基质细胞可通过细胞间直接接触和分泌因子为白血病细胞提供生长刺激信号。骨髓基质细胞可能通过相似的机制调节白血病细胞对化疗药物的敏感性。

宿主微环境与获得性的多药耐药

在体外实验中,某些肿瘤细胞与化疗药物接触一段时间后,不仅对该药耐药,对其他结构及作用机制不同的化疗药物也产生耐受(获得性的多药耐药)。临床肿瘤患者及荷瘤实验动物在接受化疗后会产生相似的多药耐药现象。值得引起重视的是,放疗和热疗等肿瘤治疗手段同样会造成多药耐药现象的产生。实验发现经热疗后,某些耐热的肿瘤细胞同时对秋水仙碱、嘌呤霉素和阿霉素等药物耐受,且有mdr1基因的扩增和Pgp的过表达。这提示在复杂的体内环境中可能存在某种通用机制以使肿瘤细胞有效对抗这些来自体外的不利因素。目前认为肿瘤细胞所处的特殊的宿主微环境所诱导的压力反应,是产生这种现象的重要机制之一,同时也是肿瘤残留灶发生耐药的原因之一。

由于肿瘤细胞的生长速度高于形成新生血管的内皮细胞的生长速度,且肿瘤的新生血管有被重新破坏的可能,所以大多数的实体瘤,特别是肿瘤内部存在着供血不足的现象,易于形成一个相对乏氧的区域。这一区域距离周围血管的距离大于氧及其他营养物的有效扩散距离,因而形成了低氧和低pH值的特殊微环境。处于这一区域中的肿瘤细胞往往在经过系统的联合治疗后仍能存活,其对抗常规治疗措施的原因主要有三方面:①由于距离血管较远,化疗药物很难到达这一区域;②这一特殊微环境中的大部分肿瘤细胞处于非增殖的休眠状态,而常规的肿瘤治疗措施一般只作用于分裂增殖较快的细胞;③这种低氧、低pH和低葡萄糖的微环境,可通过一定的信号传导途径诱导某些基因的扩增与表达,从而改变肿瘤细胞及基质细胞的生物学特性(包括对各种治疗措施的耐受)。

通过研究发现,与化疗药物的类似,缺氧的器官微环境也是染色体脆点的诱导剂,可以触发某些基因的扩增,相应的在细胞内观察到与基因扩增有关的双微区染色体(DMs)或同源染色区(HSRs)。在这些扩增基因中是否包括mdr1尚无定论,但有实验表明mdr1基因为压力基因,该基因的扩增及高表达是肿瘤细胞面临一定生存压力时所启动的生物级联反应之一,一些肿瘤细胞在特定的宿主微环境中可能通过mdr1基因的扩增与高表达作为其生存的策略。同时在这种特殊微环境中,肿瘤及其周围的基质细胞,特别是成纤维细胞也有mdr1基因的高表达。

低氧、低pH和低葡萄糖的宿主微环境还可触发肿瘤细胞的葡萄糖调节反应,即诱导定位于细胞内质网的压力蛋白GRP 78和GRP 94的表达,二者均为分子伴侣,在内质网的蛋白折叠中起到非常重要的作用。

1987年第一次报道了葡萄糖的压力反应和肿瘤耐药之间的关系。实验显示诱导GRP表达的宿主微环境可导致中国仓鼠(CHO)卵巢癌细胞对阿霉素的耐药,一旦脱离这种特殊的宿主微环境后,肿瘤细胞的耐药现象消失,同时伴随着GRP表达的下降。从而得出低氧、低养分的特殊宿主微环境可以通过葡萄糖压力反应(即诱导GRP的表达)导致肿瘤细胞耐药的结论。近年来的研究进一步的印证了这种结论。处于低氧、低pH和低葡萄糖的宿主微环境中的A431细胞GRP 78的表达量比原代细胞提高了四倍。高表达的GRP 78提高了非糖基化的表皮生长因子受体(EGFR)的稳定性(无活性),从而使非糖基化的表皮生长因子受体(EGFR)在内质网滞留,不能被正常的运输到细胞膜,导致了表皮生长因子(EGF)信号传递系统的降调节,依赖于该通路的细胞周期素D的表达量随之下降,最终使细胞周期停滞于G1期,这也是肿瘤细胞的一种特殊的防御机制。有实验表明处于这种特殊的宿主微环境中的肿瘤细胞对鬼臼毒素、阿霉素和TopoⅡ抑制剂耐药,可能与这种微环境中TopoⅡα的表达下降有关。脱离这个特殊微环境后,TopoⅡα的表达水平将得以恢复,对TopoⅡ抑制剂的敏感性也随之上升。TopoⅡ的表达量及活性对细胞周期极为敏感,该酶的表达下降是否与压力环境下大多数肿瘤细胞的细胞周期停滞于G1期有关尚不十分清楚。

肿瘤的血管新生与宿主微环境的关系

20世纪70年代,Folkman根据实验观察提出:实体瘤的生存与进展依赖于血管新生。以后的众多研究进一步验证了这一假说。直径小于1mm的肿瘤可以通过扩散途径获得氧及各种养分。而超过这一直径的肿瘤的进展(生长、侵袭和转移)必须依赖于血管新生。而且Angelo等还发现,与实体瘤类似,骨髓的血管新生同样是B细胞淋巴组织增殖性疾病(包括多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤)恶性进展(增生、侵袭和转移)的标志。肿瘤的血管新生是调节这一过程的众多正负因子共同作用的结果。主要的调节因子包括bFGF、VEGF/VPF、IL-8、PDECGF、PDGF和HFG等。宿主微环境正是通过一定机制调节这些因子的表达来影响肿瘤的血管新生,从而改变其侵袭和转移的生物学特性。

有实验表明,特定的器官微环境可影响VEGF/ VPF的表达。将人类胃癌细胞分别移植于裸鼠的胃(正位器官)及上皮(异位器官)后可以观察到:胃部肿瘤的新生血管量及VEGF的表达量均明显高于皮下肿瘤,而且有较快的生长速度。另外,人类胃癌细胞只有移植于裸鼠胃部才会发生转移。将人类成胶质细胞瘤分别移植于裸鼠的脑(正位器官)和皮下(异位器官)后得到了相似的实验结果。在肿瘤的坏死区,VEGF的表达量增加,同时体外实验中,暴露于缺氧的环境可以增加细胞VEGF的表达量,一旦氧的供应正常,细胞VEGF的表达量恢复到原代细胞的水平。由此可见缺氧的微环境可以诱导VEGF的表达。过去认为,在肿瘤的血管新生的过程中,VEGF主要是由肿瘤细胞分泌的,而Fukumura等利用标记蛋白-GFP(绿色荧光蛋白)进行的实验表明,在肿瘤血管新生的过程中,VEGF主要由基质细胞(特别是成纤维细胞)分泌,而并非肿瘤细胞。这就又一次证明了基质细胞对于肿瘤进展的重要性。与VEGF类似,bFGF 及IL-8等血管新生调节因子的水平也与特定的宿主微环境密切相关。

诊断及治疗意义

人们认识到特殊的宿主微环境对肿瘤细胞耐药及血管新生的调节作用,具有十分重要的诊断及治疗意义。宿主微环境通过诱导与耐药和血管新生有关基因的表达,使肿瘤细胞具有了侵袭转移的特性。因此,这些相关基因的蛋白即可作为肿瘤恶性进展的诊断标志。目前已有放射性同位素标记的相关蛋白抗体应用于临床显像。

同样,人们认识到宿主微环境对于肿瘤进展的重要意义,也为肿瘤的治疗(特别是对于转移灶和残留灶的治疗)提供了新的靶点。一方面,针对宿主微环境的治疗可以去除肿瘤细胞赖以生存的土壤,而且容易克服由于肿瘤的生物异质性所造成的治疗困难。另一方面,针对宿主微环境所诱导表达的特殊蛋白的治疗,由于作用于生物级联反应的终末环节,对正常组织的影响小,同时对于肿瘤转移灶和残留灶的针对性强。例如,寻找能够上调mdr1基因表达(或其他耐药机制)的器官特异性因子,可能是攻克某些难治性肿瘤对特定化疗药耐药的一种有效途径。同样抑制肿瘤血管新生,中断肿瘤的营养供给,也可达到治疗耐药的难治性肿瘤的目的,该治疗最大的优点即在于对敏感和耐药肿瘤细胞同样有效。

恶性肿瘤特别是转移灶残留灶的多药耐药(MDR)是导致化疗失败的主要原因,也是化疗急需解决的问题。MDR的形成机制复杂,迄今为止并无一种机制可用来解释所有肿瘤细胞的多药耐药现象,而且体外实验的结果与体内实验之间也存在着很大差异,这就给肿瘤细胞MDR的逆转带来了困难。但是,如果将耐药的肿瘤细胞与其所处的特殊宿主微环境作为一个相互作用的整体加以研究,这些问题就会迎刃而解,而且针对宿主微环境的研究还将为攻克耐药的难治性肿瘤(包括转移灶和残留灶)提供诊断治疗的新途径。总之,宿主微环境通过特异性因子的作用影响着肿瘤细胞的生物学特性,也为难治性肿瘤的诊断治疗提供了新的途径。

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