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微量残留白血病MRD监测方法

MRD的检测方法有多种,包括细胞培养、FISH、 Southern杂交、免疫表型和PCR方法。其中的许多方法由于敏感性、特异性和可操作性等原因在临床实际应用价值不大,如细胞培养和Southern杂交。可以在临床应用的MRD检测方法应有以下特征:

  1. 敏感度至少要达到10-3,最好能达到10-6~10-4,当然需要什么样的敏感度也要根据临床的具体需要;
  2. 为了避免假阳性的出现,应该能够把肿瘤细胞和正常细胞区分开来;
  3. 随访过程中如果诊断时的标志丢失或改变可以导致假阳性的出现,因此要求这些标志相对比较稳定;
  4. 不同实验室之间的可重复性,这是学术交流和多中心研究的需要,因此需要有标准化操作规范和好的质量控制;
  5. 为了适应临床的需要,应该可以迅速得到结果;
  6. 可以进行定量。综合这些因素,目前能够适应血液系统恶性疾病临床应用的MRD检测方法主要是多参数流式细胞仪检测免疫表型、PCR检测融合基因或抗原受体基因重排。下面分别对各种MRD检测方法的特点给予介绍。

细胞培养方法

利用特殊培养体系,有利白血病细胞而不利造血细胞生长,以检测白血病集落。然而,由于培养体系成分不稳定,培养方法难以标准化,此外,还有正常细胞假阳性的干扰,因而需要借助其他方法来判定白血病细胞。这种方法由于敏感性和特异性都不高,临床应用价值有限,目前已很少应用。

细胞遗传学方法

常规细胞遗传学技术:采用常规细胞遗传学方法,在白血病诊断时确定出染色体异常,然后借此检测残留病;其主要优点是鉴别白血病细胞确切。由于其敏感度太低,临床上很少应用这种方法检测MRD。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH):该方法是用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针,通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数目和结构的异常。其主要优点是能与形态学和免疫化学结合起来,并能用于间期细胞。目前,由于荧光显微镜装配有双道和三道滤片,故可同时检测2~3个探针。探针类型:包括染色体中心体特异性探针,可用于单体型、三体型或其他非整倍体染色体的识别;全染色体图形探针,可绘制染色体图形;根据染色体易位断点设计的特异性探针可识别标记染色体,用于残留白血病的检测。该方法的优点是形象直观、定位准确,且能量化。但由于其敏感度只能达到10-3~10-2,在临床的应用受到很大的限制。

多参数流式细胞仪

多参数流式细胞仪(multiparameter flow cytometry,MFC)。多参数流式细胞仪检测MRD依赖于肿瘤细胞异常的免疫表型,这包括交叉系列抗原表达、抗原表达不同步、抗原表达水平的升高或降低。多参数流式细胞仪可以定量,其敏感度最高可以达到10-5,但在实际应用过程中一般只能达到10-4。可以用于Ph染色体阳性的高危白血病的MRD监测,对化疗敏感的白血病,由于敏感度较低,有一定的局限。而且白血病细胞在治疗过程中会有免疫表型变化,每个患者往往需要两个异常免疫表型才能实施有效的MRD监测。

聚合酶链反应方法

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。PCR方法扩增的肿瘤特异核苷酸序列包括染色体易位的断裂点结合区、患者特异的抗原受体基因重排序列和异常表达的基因。染色体易位的断裂点结合区可以作为肿瘤特异的PCR扩增靶序列,虽然基因组DNA可以作为模板,但这要求断裂点变化的区域小于2kb,但绝大多数染色体易位断裂点变化的区域都大于2kb,因此更好的选择是用cDNA作模板。单次PCR的敏感度在10-3~10-2,巢式PCR可以将敏感度提高到10-6~10-4,这完全可以满足诊断的需要。每个淋巴系统肿瘤细胞克隆都具有特异的抗原受体基因重排序列,可以作为肿瘤细胞的标志检测MRD。异常表达的基因也可以作为肿瘤细胞的标志检测MRD,这种情况的代表是在血液肿瘤高表达的WT1基因。过去PCR方法只能定性或半定量,近年出现的实时定量PCR技术改变了这一状况,可以对MRD进行定量。针对融合基因的实时定量PCR方法,其敏感度高,可以达到10-6~10-4。在治疗过程中,白血病细胞会持续表达融合基因,不会因为克隆演变而丢失。由于每个患者的融合基因相似,操作过程中有时会有交叉污染。针对TCR、IgH重排的实时定量PCR,需要合成患者特异的引物,敏感性可以达到10-5~10-4。由于每个患者的重排位点是特异的,不会有交叉污染。只是在诊断时确定重排位点较为费时。由于白血病在治疗过程中克隆演变,最好考虑同时检测两个重排位点。

另外,这几种方法检测出的MRD结果并不能简单地进行比较,目前的研究认为,多参数流式细胞表型和针对TCR、IgH重排的实时定量PCR有一定的可比性,而二者与针对融合基因的实时定量PCR没有可比性。

这几种方法目前都没有国际通行的标准化操作规程,由于方法没有标准化,MRD检测的结果在各个实验室间还不能进行比较。只有根据标准化操作规程进行的临床实验才能确定根据MRD进行治疗是否能够提高疗效,只有这样的临床实验结果才能推广使用,因此MRD检测方法的标准化是目前急需解决的一个问题。除了检测方法的标准化,对检测结果的解释也需要通过临床实验确定一个国际通用的指南。国外在这些方面已经取得了一些进展,如ESG-MRD-ALL(European Study Group on MRD detection in ALL)是一个对ALL的MRD检测进行标准化的组织,目前,他们已经在其组织内部建立了RQPCR方法的标准化操作方法和质量控制,也初步完成了对TCR、IgH重排RQ-PCR结果解释指南的建立。

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