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微量残留白血病MRD监测的临床研究

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)

儿童ALL

在儿童ALL治疗过程中MRD的监测可以了解患者对治疗的反应和复发的危险,一些大系列的前瞻性临床试验结果显示治疗开始的前几周MRD水平具有预后意义。圣Jude儿童医院用流式细胞仪研究了110例儿童ALL的MRD水平,他们发现90%的儿童ALL都有特殊的免疫表型标志用于MRD监测,发现诱导治疗第19天MRD小于0. 01%的ALL 3年累积复发率为(1. 9±1. 9)%,而MRD大于0. 01%为(28. 4±6. 4)%。其他的临床试验也证实了治疗开始的前几周MRD水平的独立预后意义。虽然这些研究都证实了流式细胞仪进行MRD监测的可行性和预后意义,由于目前没有一个标准化的操作流程,因此各个中心的研究结果是很难比较的。

经过几年的努力,欧洲的BIOMED研究组织已经建立了一套用PCR检测基因重排监测MRD的标准化操作流程。Cave等人用半定量PCR的方法检测了178例儿童ALL缓解早期的MRD水平,他们发现形态学缓解后仍能检测到高水平(大于10-2)MRD的高度预示复发,而低水平MRD和MRD阴性的预后良好,并且预后相似。其他的一些研究者也发现要达到长期的无病生存并不一定要完全清除MRD,这些残留白血病克隆的性质还不清楚,但这也提示白血病发生是一个多步骤的过程。这些研究也提示单个时间点的MRD水平并不能提供足够的预后意义,而一系列MRD水平的变化能够提供更多的预后意义。van Dongen等人用半定量PCR方法检测了240例儿童ALL一系列时间点的MRD水平,发现据此可以将患者分为3个组,43%的患者为低危组,3年复发率为2%;43%为中危组,3年复发率为23%;15%为高危组,3年复发率为75%。I-BFM、Dana Farber和COG的临床试验也证实了这种动态定量MRD检测方法的临床意义。但是,具体哪个时间点的MRD具有临床指导意义与治疗方案有关。

由于采集外周血痛苦更小,更容易被患者接受,许多研究者也对比研究了外周血检测的MRD是否与骨髓相似,是否具有相似的临床意义。目前的研究显示,用流式细胞仪和PCR方法检测的MRD,对于T-ALL外周血和骨髓的结果是具有可比性的。而前体B-ALL的研究结果并不一致,因此,根据目前的研究结果,骨髓的MRD检测仍然是前体B-ALL的金标准。

成人ALL

对于成人ALL的MRD监测的研究虽然没有儿童ALL那么多,但是治疗过程中的MRD监测也显示了明显的临床意义。但是成人ALL治疗后MRD的阳性率更高。通过PCR方法检测克隆特异的基因重排发现,诱导治疗后高MRD水平(与内参基因相比大于10-3)提示高复发率(89%),CALGB用定量PCR方法也得出了相似的结果。可是低水平的MRD(与内参基因相比小于10-3)也有较高的复发危险(46%)。在另一个前瞻性研究中用定性PCR方法对比了长期无病生存的前体B-ALL和复发患者的动态MRD水平。长期生存患者的MRD阳性率由诱导缓解后的36%,降到治疗10~24个月的7%;而复发患者两个时间点的阳性率分别为64%和56%。这一研究认为所有时间点的MRD都具有提示复发的临床意义,但4~9个月MRD的临床意义最大。而且MRD在多因素分析中具有独立的预后意义。同样,用流式细胞仪的方法在缓解后任一时间点检测到高水平的MRD(大于10-3)也高度提示复发(复发率94%)。

研究显示治疗过程中一系列时间点的动态MRD水平可以增强它的复发预测价值。GMALL的多中心临床研究发现治疗第一年动态MRD的预测价值要明显高于任何单一时间点。他们用定量PCR方法检测了196例标危成人ALL治疗第一年的MRD动态变化,他们发现根据治疗开始前16周3个时间点的MRD水平的动态变化可以将这些患者分为3组,MRD快速下降(诱导治疗的第11天或第24天的MRD小于10-4)患者的3年复发率为0%;MRD缓慢下降(治疗16周的MRD大于10-4)患者的3年复发率达94%;其余的患者为中危组,复发率为47%。因此治疗过程中MRD的定量检测可以将标危组成人ALL进一步按复发危险度进行分层,实现分层治疗。

具有特异融合基因ALL的MRD监测

一些学者用PCR方法扩增白血病特异的融合基因(如MLL-AF4,BCR-ABL)检测MRD,研究了高危ALL进行MRD监测的意义。t(4;11)染色体易位产生了MLL-AF4融合基因,所有成人和儿童ALL中的3%~6%可以发现这种异常,尤其多见于婴儿ALL。这些患者的预后不良。一个前瞻性临床研究用定性PCR方法检测了25例MLL-AF4阳性ALL的MRD变化,治疗后3~6个月MRD阴性患者的生存期得到了延长。一些研究发现MLL-AF4阳性ALL移植后,MRD仍为阳性或由阴性转为阳性患者都将复发。

20世纪90年代晚期,学者发现Ph+的ALL移植后用RT-PCR方法检测BCR-ABL融合基因可以预测患者的复发。许多研究都发现用定性PCR方法检测移植后Ph+ALL的MRD,持续阴性的患者复发率很低,而阳性患者则有很高的复发危险。Radish等人的研究结果显示MRD阳性患者的复发危险明显高于阴性患者(RR = 5. 7,P = 0. 025)。而且,MRD阳性复发的危险与BCR-ABL产物的类型有关,移植后p190 BCR-ABL阳性患者复发的危险要高于p210 BCR-ABL阳性患者。从PCR阳性到复发的中位时间为94天。

Ph+ALL患者移植后的无复发生存时间与移植前MRD的水平也有关,基于这些结果,移植前应尽可能降低这种高危患者的MRD水平。目前,许多研究都将ABL激酶的抑制剂伊马替尼用于Ph+ALL的一线治疗,定量PCR的结果显示,应用伊马替尼后大多数(82%)患者移植前MRD都转为了阴性,中位随访25个月,这些患者的无病生存得到提高。

移植患者的MRD监测

移植前后MRD监测的预后意义不仅限于Ph+ALL患者,用PCR方法检测TCR/IgH基因重排监测MRD发现,所有ALL患者移植前后的MRD都具有明显的预后意义。两个大系列的研究用半定量PCR方法研究了儿童ALL移植前MRD的预后意义,两个系列移植前MRD阴性患者的无病生存率都是78%,中等MRD水平患者的无病生存率分别为48%和36%,高MRD水平(但在临床缓解状态)患者的无病生存率分别为23%和0%。表中绝大多数研究都显示移植前高MRD水平提示移植后高的复发率,只有一个成人ALL的临床研究认为,移植前的MRD水平没有预后意义,但这个研究结果还是提示移植后MRD阳性高度预示复发。几个对MRD进行动态监测的临床试验发现,移植后MRD阳性患者往往在移植后几个月内复发。综合这些研究我们可以看出,移植前MRD的阳性提示移植后复发,因此,移植前应尽可能使患者的MRD转阴。

以MRD为基础的分层治疗

研究已经证实MRD是白血病重要的独立预后因素,因此,许多学者已经开始尝试研究以MRD为基础的分层治疗。这主要包括两个治疗策略:对高MRD患者进行强化的缓解后治疗;对低MRD或MRD阴性的患者,降低治疗强度或缩短治疗时间。北美儿童肿瘤研究组已经用4色流式监测诱导治疗后14天和29天的MRD水平指导治疗,根据这两个指标定义的高危组患者将接受强化的缓解后治疗。Dana Farber的ALL研究组也已经根据MRD进行缓解后的分层治疗,他们用定量PCR方法监测MRD,诱导治疗后高MRD水平的患者将额外接受柔红霉素和(或)阿糖胞苷的强化治疗,这个研究并没有对低MRD患者减低治疗强度。欧洲的BFM-AEIOP用定量PCR检测MRD,对高MRD患者在CR1进行异基因移植,而对低MRD患者则减低缓解后治疗强度。对于成人ALL,GMALL正对标危成人ALL进行一项前瞻性研究,对MRD低危(缓解后所有时间点的MRD水平小于10-4)的患者在治疗一年后停止治疗,也不进行维持治疗;对MRD高危(缓解后任何时间点的MRD水平大于10-4)的患者进行强化治疗,主要是异基因移植。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)

一、免疫学方法监测AML的MRD部分AML交叉表达TdT,在没有流式细胞仪以前是根据这一特点进行MRD检测,流式细胞仪出现后,这种方法就不再使用了。AML细胞往往有抗原的异常表达或抗原表达强度的变化,根据这个特点可以使用多参数流式细胞仪对绝大多数AML患者进行MRD监测。CALGB的研究显示,与ALL不同,AML细胞在复发时出现免疫表型转换的频率更高,因此用多参数流式细胞仪检测AML的MRD,尤其是预测复发时要注意AML免疫表型转换。目前建议诊断时至少需要记录两个异常免疫表型用于以后的MRD检测。

Wolfgang Kern等人的研究提示AML诱导治疗后和巩固治疗后的MRD水平与无复发生存和总生存都相关。但Adriano Venditti等人的研究认为AML诱导治疗后的MRD水平与预后没有关系,而巩固治疗后的MRD水平与无复发生存和总生存都相关,巩固治疗后MRD大于3. 5×10-4患者的复发危险(77%)明显高于MRD小于3. 5×10-4的患者(17%)。San Miguel等人根据诱导治疗后的MRD水平分为4组:小于10-4;在10-4和10-3之间;在10-3和10-2之间;大于10-2。它们的3年累积复发率分别为0%、14%、50%和84%,并且MRD的水平是AML的独立预后因素。从目前的研究结果来看,巩固治疗后的MRD水平与预后明显相关,多因素分析表明它是独立的预后因素,诱导治疗后MRD水平与预后的关系已经得到了多数研究结果的支持,但还需要进一步研究的确认。

缓解后治疗对高水平MRD患者预后影响的研究还较少,还没有一致的结论。Edward Laane等人的研究发现巩固治疗后高MRD水平AML分别进行异基因SCT、自体SCT和化疗的5年无复发生存率分别为80%、53%和0%(P= 0. 003),从中可以看出SCT可以改变高MRD水平AML的预后。但Adriano Venditti等人的研究发现自体SCT并没有改变高MRD水平AML的预后。

初步的研究结果显示AML移植后流式细胞仪检测的MRD水平与复发是相关的。而且,AML的自体移植患者采集物中检测到白血病特异的免疫表型往往预示移植后复发。相应,自体外周血干细胞采集物中MRD水平大于或等于10-3也预示移植后复发,中位复发时间为6个月。

对AML用多参数流式细胞仪检测MRD也可以使用外周血。Luca Maurillo等人研究发现外周血检测的MRD结果与骨髓具有相关性,巩固治疗后外周血MRD大于1. 5×10-4患者的复发危险(82%)明显高于MRD小于1. 5×10-4的患者(10%)。

目前用多参数流式检测MRD研究使用的MRD分界值差异较大,范围大致在10-4~10-3。这一方面与每个研究的入组患者有关,但更主要是由于目前流式细胞仪检测MRD没有一个国际通用的操作规范,导致各个实验室之间的检测结果没有可比性,这是一个急需解决的问题。

二、RT-PCR监测APL的PML-RARα融合基因AML的MRD研究中,RT-PCR方法监测APL的PML-RARα融合基因的研究最多,许多回顾性和前瞻性研究都证实了RT-PCR方法监测PML-RARα在指导治疗APL中的重要意义。对APL的MRD检测应使用低敏感度(10-4)的PCR,更高敏感度的PCR会出现假阳性。

APL诱导治疗缓解结束后,大约一半患者PCR检测MRD呈阳性,包括MRC、GIMEMA和PETHEMA等的临床试验都表明这时PCR阳性对预后没有影响。因此如果不是临床研究的需要,诱导治疗缓解后没有必要进行MRD的检测。虽然巩固治疗后PCR方法PML-RARα转阴不能排除以后复发,但巩固治疗后PML-RARα阳性强烈提示以后的血液学复发,因此巩固治疗完成后必须进行PCR方法的MRD检测,阴性者可以进行维持治疗,阳性者需要进一步的强化治疗。目前使用ATRA联合化疗APL,在治疗结束时,几乎所有的患者都可以PCR转阴,但仍然有20%~30%的患者会复发。因此,为了监测APL的复发风险,在治疗结束后的2~3年需要进行连续MRD的监测,以便早期发现复发。再次检测到MRD往往预示血液学复发,中位复发时间为2~3个月。根据这些研究,提出了APL分子生物学复发的定义:治疗后RT-PCR阴性的APL,随访过程连续两次骨髓标本MRD阳性。Lo Coco等人的研究显示,在分子生物学复发时就开始治疗患者的2年无事件生存率要高于血液学复发时开始治疗的患者(分别为92%和44%)。对于第二次缓解的APL患者,其中一个治疗选择就是干细胞移植,用PCR阳性的自体移植物进行移植,以后往往会复发。因此,对第二次缓解期MRD阳性的APL,应考虑包括无关供者异基因SCT在内的强烈治疗,对MRD阴性的患者则可以进行自体SCT。

由于骨髓比外周血更容易检测到PML-RARα转录本,因此APL的MRD检测骨髓是优于外周血的。在NCCN的治疗指南中巩固治疗后检测MRD时应使用骨髓,但允许维持治疗随访时用外周血进行MRD检测,但如果出现阳性,应再取骨髓确认结果。

三、RT-PCR监测AML1-ETO融合基因 PCR方法检测t(8;21)AML的MRD的临床意义比APL小,一些研究发现化疗甚至异基因SCT后长期生存的患者中仍然能够检测到AML1-ETO转录本,因此治愈t(8;21)AML并不一定要使MRD转阴。目前还不能确定这些AML1-ETO转录本是否等同于白血病克隆的存在,但基础研究的结果提示,这些长期缓解患者体内的AML1-ETO阳性细胞具有多向分化潜能,可能是白血病发生多步骤过程中早期的克隆,并不具备发生白血病的能力。研究结果显示治疗过程中,半定量或定量PCR检测的AML1-ETO转录本逐步下降到非常低的水平或转阴,往往预示持续的临床缓解。相反,治疗过程中MRD水平明显增高往往预示以后的血液学复发。而且外周血中AML1-ETO的转录本虽然比骨髓的低10倍,但它的临床意义与骨髓相同。

绝大多数t(8;21)AML的自体外周血采集物中都有表达AML1-ETO的细胞,但这并不提示自体外周血干细胞移植后一定会复发。

四、RT-PCR监测CBFβ-MYH11融合基因 有几个小系列的研究用RT-PCR的方法分析了AMLM4Eo治疗后MRD的动态变化,在达到血液学缓解后几个月MRD仍可以为阳性。虽然长期生存患者的CBFβ-MYH11融合基因转录本通常为阴性,但也有研究发现在长期生存的患者可以检测到CBFβ-MYH11转录本。移植前CBFβ-MYH11转录本通常为阳性,这与移植后的疗效没有关系,但是,移植后CBFβ-MYH11转录本迅速转阴往往提示预后良好。

几个研究都认为治疗后高复发危险和低复发危险患者的MRD水平有明显的差异,如果持续存在高水平的MRD往往预示以后的血液学复发,但不同的研究者给的分界值是不一样的,这可能还是由于目前没有一个国际通用的操作规范,导致各个实验室之间的检测结果没有可比性。

五、其他AML的MRD监测 78%~80%的成人AML高表达WT1,因此可以将它作为MRD检测的标志。初期使用定性PCR的研究结果并不一致,但随着定量PCR的应用,WT1可以作为MRD的标志得到了多数临床研究的证实。Weisser M等人的研究认为治疗开始60天内用WT1作标志检测的MRD没有预后意义,但60~180天时有预后意义,缓解患者WT1表达升高后复发的中位时间为38天(8 ~180天)。但Hélène Lapillonne等和Daniela Cilloni等的研究都认为诱导治疗后WT1作标志检测的MRD有预后意义,而且可以将AML按复发危险度分为两组指导后续治疗。WT1也可以用作自体或异基因SCT后MRD的标志,预测复发。

t(9;11)AML的MLL-AF9融合基因也可以用于检测MRD,有研究发现t(9;11)AML治疗后MRD快速转阴的患者往往处于长期缓解状态,MRD持续存在则预示以后的复发。NPM1的12外显子突变是近年发现的AML异常,国外报道有约50%的AML有此突变,但国内小系列的研究显示我国AML 的NPM1突变发生率较低,28例初治AML-NK中仅4例阳性。近年有研究者开始用这一突变作为检测MRD的分子标志,小系列的研究显示用NPM1检测的MRD结果可以判断预后,提前预测复发,但这还需要进一步的研究证实。

综上所述,无论是PCR还是流式细胞仪检测的MRD,在AML都具有明显的临床意义。而且,这些方法能够发现血液学复发危险高的患者,从而可以提早进行强化治疗,提高疗效。化疗敏感的AML[如t(15;17)、t(8;21)或inv(16)]往往在第一次缓解期不推荐移植,一系列时间点的动态MRD监测可以从中发现耐药的患者,从而可以进行包括移植在内的更加强烈的缓解后治疗。

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)

CML治疗的疗效可以表现在血液学、细胞遗传学和分子遗传学三个水平,因此其MRD的检测可以从细胞遗传学和分子遗传学两个水平进行,针对这种情况,国内外的学者根据相应的MRD水平制定了相应的疗效标准。

酪氨酸激酶抑制剂治疗后的MRD监测

伊马替尼治疗CML 18个月有76%的患者可以达到CCR,42个月时85%达到CCR,因此经伊马替尼治疗CML的疗效监测需要敏感度高的PCR方法。在伊马替尼的3期临床IRIS试验中,伊马替尼治疗12个月时,57%的患者达到了MCR,他们在以后12个月的无进展生存率达100%;而达到CCR没有达到MCR患者在以后12个月的无进展生存率为95%,两组之间差异显著(P<0. 001),在治疗42个月时两者的无进展生存率分别为98%和90%。因此IRIS试验证实了CML的无进展生存率与BCR-ABL转录本的水平密切相关,同时IRIS试验也初步建立了一个检测CML的BCR-ABL转录本的定量PCR操作规范。IRIS试验将30个治疗前患者外周血BCR-ABL/ BCR的平均水平作为标准基线水平,所有患者治疗后的MRD都是与这个标准基线对比,BCR-ABL转录本比这个标准基线下降不小于3个log就定义为MCR。在IRIS试验中,BCR-ABL转录本下降到基线4. 5个log是可检测的极限。IRIS的检测方法有2个优点:一是许多CML患者治疗前没有BCR-ABL转录本基线水平,这个方法可以对这些患者进行检测;二是各个实验室如果所定义MCR的BCR-ABL转录本水平相当,他们的结果就具有可比性。但是由于目前还没有国际公认的标准品,定量PCR检测BCR-ABL转录本的方法实际上还没有一个国际通用的操作规范。

对于使用伊马替尼治疗的患者,应定期进行血常规、细胞遗传学和定量RT-PCR的检查。如果治疗3个月没有达到CHR,或者6~12个月没有达到细胞遗传学缓解,或者以前已经获得血液学或细胞遗传学缓解再次复发,那么CML慢性期患者伊马替尼的剂量可以从每天400mg增加到每天600mg,进展期患者伊马替尼的剂量可以从每天600mg增加到每天800mg。目前伊马替尼是酪氨酸激酶抑制剂中使用最广泛、经验最多的,其他酪氨酸激酶抑制剂如达沙替尼、尼罗替尼治疗CML的MRD监测可以参照伊马替尼。

干细胞移植治疗后的MRD监测

初期报告有些混乱,随着PCR技术规范化,各实验室结果趋向于一致:大部分患者于SCT后6~9个月RT-PCR检测为阳性,以后逐年转为阴性。因此,CML患者于SCT后早期RT-PCR检出阳性没有什么预后意义。CML移植后达到分子遗传学缓解的中位时间为540天,而细胞遗传学缓解的中位时间为92天。SCT后一年内RT-PCR转阴的患者多数治愈,而SCT一年后RT-PCR仍为阳性的患者复发率明显增高,但并不是所有RT-PCR阳性的患者都会复发。目前,用定量PCR的方法动态监测MRD的变化可以发现高复发危险的患者,这些患者往往是血液学或细胞遗传学复发前几个月常常出现MRD水平的增高,复发前MRD的快速增高预示疾病可能进入加速或急变期。处于缓解状态患者MRD的水平一般持续下降或持续处于低水平,一些患者异基因移植10年后BCR-ABL基因转录本仍可处于低水平阳性。处于分子水平复发的患者可以进行供者淋巴细胞输注免疫治疗,一些患者可以再次PCR转阴,这时治疗的疗效要好于血液学或细胞遗传学复发。近期的研究发现分子生物学复发治疗的疗效要好于细胞遗传学复发,治疗后两组达到完全嵌合的比例分别为93. 3%和44. 4%(P<0. 015),MCR的比例分别为83. 3%和57. 9%。

IFN-α治疗后的MRD监测

对于选择IFN-α治疗的患者,大约20%~30%的患者可达到完全或部分细胞遗传学缓解,还有10%的患者可以达到次要细胞遗传学缓解,绝大多数完全细胞遗传学缓解的患者都可以检测到BCR-ABL基因转录本。细胞遗传学方法评价的MRD水平与IFN-α的疗效是相关的,完全细胞遗传学缓解患者从IFN-α治疗中获益最大,但与羟基脲相比低水平的细胞遗传学缓解患者也可以从IFN-α治疗中获益。Kurzrock等人认为IFN-α治疗后长期完全缓解的患者有可能PCR转阴,但其他学者还是认为可以检测到低水平的MRD。

综上所述,许多情况下定性PCR并不足以预测CML的病程,目前应用的定量PCR能够满足这一需要。定量PCR可以发现治疗后瘤负荷很低(分子水平复发),但有较高的血液学复发的危险,对这些患者提早治疗可以提高疗效。最后,研究已证实CML骨髓和外周血MRD的监测结果具有可比性,因此可以使用外周血对CML进行MRD监测。

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)

检测CLL的MRD的临床意义

以往CLL的CR是沿用NCI的标准,即骨髓中淋巴细胞小于30%。这时用更加敏感的PCR或MFC可以检测到MRD。随着近年氟达拉滨和免疫治疗的开展,研究者开始关注获得MRD阴性的CLL是否可以进一步提高疗效。Rawstron等对获得CR的CLL进一步进行自体SCT或免疫治疗,治疗后MRD阳性患者的无事件生存和总生存比MRD阴性患者都明显差。Bosch等对FCM方案治疗后CR的CLL检测了MRD,发现MRD阴性组OS明显好于MRD阳性组,但两组的无事件生存差异不显著(MRD阴性:21个月;MRD阳性:17个月)。Wierda等对FCM方案治疗后CR的CLL进行了研究,发现MRD阴性和MRD阳性组的无进展生存时间分别为44个月和27个月。Moreton等对阿伦单抗(alemtuzumab)治疗后CR的CLL研究发现,MRD阴性组和MRD阳性组的无治疗生存和总生存都有显著的差异。目前这些资料都是来自非随机临床试验,目前英国正在进行的随机临床试验结果出来后,将可以非常明确地回答MRD转阴能否改善CLL的预后。不过从现有资料看,达到MRD转阴的缓解可以明显改善CLL的总生存,以MRD为基础对CLL疗效的评价要比NCI单纯形态学的缓解更有意义。

对CLL进行MRD监测时应记住,到目前为止CLL还是一个不可治愈的疾病,CLL达到MRD阴性不等于治愈,因此目前的观点还是认为只能对部分CLL进行以MRD转阴为目标的治疗。对哪些患者应进行这种治疗现在还没有一致的看法,多数研究者认为身体条件好、疾病进展、有症状的患者,尤其是那些有不良预后因素的患者,应更多地考虑这种治疗。

许多研究都认为MRD阳性是CLL的不良预后因素,在CML和APL都主张在分子复发时即开始治疗能取得更好的疗效,但目前还没有证据支持在分子复发时治疗比在临床复发时治疗可以取得更好的疗效,因此除临床试验外不主张CLL在分子复发时就开始治疗。

检测CLL的MRD的方法

CLL的MRD的检测方法有两种,一个是MFC,另一个是用PCR方法扩增免疫球蛋白重链基因重排,两种方法各有特点。PCR方法根据引物不同分为两种。一种是使用共用引物扩增,敏感度可以达到10-4~10-3,优点是快速,缺点是由于存在免疫球蛋白重链可变区的突变,共用引物不能检测所有CLL患者的MRD。另一种方法是使用患者特异的引物,即等位基因特异性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,ASO),这种方法的敏感度最高,可以达到10-6。但这种方法需要对每个患者合成引物,费时,成本高,这大大限制了它的应用。最初MFC对MRD的检测是使用双色(CD19/CD5)检测,其敏感度只能达到10-3~10-2,这限制了它的应用。随着多色流式细胞仪的应用,现在用四色流式可以将敏感度提高到10-5,可以很好地满足临床应用。并且国际上已经将这种方法进行了标准化,有商品化的试剂销售。综合各个方面,MFC要优于PCR方法,也可能就是这些原因,目前英国关于CLL的MRD的随机临床试验就是使用四色流式细胞仪检测的。

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)

带有t(14;18)的滤泡淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)

1)FL化疗治疗后的MRD监测:恶性度分级高的FL骨髓和外周血中常常有淋巴瘤细胞,对这部分患者的MRD检测尤为重要。大多数临床研究都针对t(14;18)产生的bcl2-IgH融合基因进行PCR扩增检测MRD。对于骨髓和外周血同时受累的FL患者,骨髓MRD的意义要大于外周血。经过一年的化疗,一半以上FL的MRD可以转阴,这常常预示更长的无复发生存。但是对于t(14;18)阳性的晚期(Ⅲ/Ⅳ期)FL,MRD转阴与无复发生存没有关系。利妥昔单抗(美罗华)与化疗联合治疗FL可以使一部分PCR转阴的患者处于持续的临床缓解状态。

2)FL自体移植治疗后的MRD监测:PCR方法扩增bcl2-IgH融合基因检测MRD,自体骨髓移植后如果持续处于分子水平缓解的患者不会复发,相反,大多数持续阳性的患者会复发。自体外周血干细胞移植后,再次出现PCR阳性预示着复发。但也有研究发现,大多数患者自体骨髓移植后MRD仍阳性,而且PCR方法检测的MRD与无复发生存之间不相关。

3)检测FL的MRD技术上存在的问题:局部FL经放疗后长期临床缓解的患者外周血中也可以检测到t(14;18)阳性的细胞,而且在正常人也可以检测到t(14;18)阳性的细胞,因此,敏感的PCR方法扩增bcl2-IgH基因检测MRD结果的临床意义还需要进一步研究。同时,由于目前没有一个国际公认的操作规范,不同实验室PCR扩增bcl2-IgH基因的结果也有差异。由于污染或正常人t(14;18)阳性的细胞,PCR方法会有假阳性,这可以通过设计针对患者bcl2-IgH融合区域的碱基序列设计引物,这种引物对每个患者是特异的,可以避免假阳性。

IgH基因重排为基础的MRD监测

由于只有20%~30%的NHL有融合基因,PCR扩增融合基因监测MRD的方法只能适用于这一小部分患者。而70%~90%的NHL都可以检测到IgH基因重排,因此用PCR方法扩增IgH可以对绝大多数NHL进行MRD监测。

套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)具有IgH基因重排和bcl1-IgH融合基因,通过PCR方法进行MRD监测发现,MCL在治疗过程中MRD持续阳性,骨髓或外周血的MRD水平在10-3~10-2,提示MCL对传统化疗耐药。

PCR方法扩增IgH重排可以评价NHL自体骨髓采集物体外净化的效果,体外净化对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)效果不佳,但对50%的FL有效。自体SCT移植后骨髓持续MRD阳性FL的临床复发危险高于MRD阴性的FL,但是,IgH重排持续存在的患者也可能长期完全缓解。对于晚期的FL或MCL用患者特异的PCR检测MRD,大剂量化疗后一些FL可以采集到MRD阴性的自体骨髓采集物,这些患者移植后中位随访24个月没有复发,这一研究提示用MRD阴性的自体骨髓或外周血采集物进行SCT是治疗FL的有效策略。但是无法采集到MRD阴性MCL患者的骨髓或外周血干细胞。MCL患者回输MRD阳性的移植物都会复发,因此对晚期MCL,异基因SCT是唯一有效的治疗方法,移植后MRD转阴的患者可能获得长期的血液学缓解。

(魏辉)

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