免疫PCR分为单组分/多组分/双相/免疫PCR-ELISA联合检测四种

根据免疫PCR一次实验检测的组分多少分为单组分和多组分分析免疫PCR;或根据标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列区,可用单引物进行PCR扩增的方法称单引物免疫PCR;还根据检测目的和PCR扩增产物的检测方法不同,又称为双相免疫PCR和ELISA联合检测免疫PCR。

一、单组分分析免疫PCR

是指在某一抗体上只标记一段特定的DNA分子,其免疫反应产物和PCR的DNA扩增产物只能检测到某一种待测组分的免疫PCR。

二、多组分分析免疫PCR

即在同一免疫反应体系中同时检测多种抗原组分。放射性核素、酶、荧光素和化学发光等标记抗体的技术,虽已被开发用于同时检测多种组分,但来自不同标记物的重叠信号和扫描不同密度的信号存在困难,从而使这些技术的实用性受到严重影响。相对而言,DNA为区别多组分提供了较理想的分子标记物,大小不同的DNA分子可以通过电泳等技术而分离,为各组分的定量分析创造了前提条件。Hendrickson等用99个碱基对(99bp)的寡核苷酸(99bp-ONT)标记人绒毛膜促性腺激素(HCG)抗体、85bp-ONT标记人促甲状腺激素(hTSH)抗体和55bp-ONT标记β-半乳糖苷酶(β-Gal)抗体,同时检测HCG、hTSH和β-Gal 3个组分。在PCR扩增时,3个寡核苷酸应用一对引物,其产物为99bp、85bp和55bp,因而各组分得以分离和分析。

三、双相免疫PCR

是指抗原组分和目的基因同时检测的免疫PCR。其方法是将一对用于扩增某基因的引物加在标记抗体的DNA marker的两端,使被测组分(抗原)共用一对引物,但DNA扩增终产物的分子量大小不同,从而达到免疫PCR在检测某抗原的同时又检测了目的基因。

四、免疫PCR联合ELISA检测

PCR扩增的产物通常是用凝胶电泳、溴乙啶(EB)或SYBR绿色Ⅰ染色的方法来进行定量分析,或在凝胶电泳后用Southern杂交法检测PCR产物,但这些方法操作繁杂,检测灵敏度低,定量的准确度和精密度较差,难以达到实用要求。测定PCR产物也可不用电泳,在PCR扩增时用放射性核素、荧光素、生物素、酶等标记PCR引物,使PCR产物带有一定量的标记,然后通过放射自显影、荧光显微镜、酶底物显色等显示检测结果。Niemeyer等报告将免疫PCR与ELISA技术联合应用,即用ELISA定量检测免疫PCR的扩增产物。它主要是用一对分别标记了生物素和地高辛的引物来扩增标记DNA,以亲和素作为捕获抗体固定扩增产物,再用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA检测扩增产物。

在检测鼠和兔IgG及重组HBsAg时证实,与凝胶电泳EB显色法比较,ELISA定量检测PCR扩增产物结果的稳定性和精密度要好得多。凝胶电泳EB显色法检测PCR扩增产物的精密度变异系数(CV)达到38%(为不可接受的程度),而ELISA的CV为10%。并且,以荧光染料AttoPhos作为显色底物的ELISA,其检测灵敏度比凝胶电泳EB显色法高10倍,被测组分的含量与荧光强度呈正相关。免疫PCR与ELISA联用检测法更节省时间,且便于临床样品检测的自动化。近年来采用实时PCR(real-time PCR)检测PCR产物,大大增加了免疫PCR的灵敏度、准确度和精密度。

应用蛋白A-链亲和素或生物素-亲和素及化学法标记示踪物

根据免疫PCR中连接或标记DNA与抗体所用的连接物或方法不同,分为下列几种连接法或标记法。

一、蛋白A-链亲和素(protein A streptavidin)法

1991年,Sano等采用基因工程方法在大肠埃希菌中合成并获得蛋白A-链亲和素嵌合体(即重组融合蛋白),其中蛋白A能特异地与IgG分子的Fc段结合,而又不影响IgG与抗原的结合能力;链亲和素又能特异地与生物素结合。研究者将小牛血清白蛋白(BSA)作为抗原固定在微量板上,加入抗BSA的单克隆抗体,再加入与生物素标记的质粒DNA(Biotin-pUC19)结合的蛋白A-链亲和素融合蛋白,从而将特定DNA间接吸附于固相,然后选用适当引物进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳和EB染色检测扩增产物,并检测出只有580个抗原分子的BSA(即9.6×10-22mol/L水平)。

二、生物素-亲和素(biotin-avidin)法

由于蛋白A-链亲和素连接DNA与抗体的连接物是蛋白A-链亲和素融合蛋白,限制了该法的临床实用性,且蛋白A对抗体不同亚型有不同的亲和力。Ruzicka等用亲和素代替蛋白A-链亲和素,分别连接生物素化的单克隆抗体(biotinylated-McAb)和生物素化的DNA(biotinylated-DNA)。Maia等和Suzuki等用此标记法建立的双位点夹心法,分别检测HBsAg和胃癌相关抗原SICAM-1,灵敏度均较传统ELISA法提高1000倍。

三、化学直接标记法

上述两种方法都是将DNA间接连接到抗体上,为减少测试反应过程中的非特异性吸附,反应板需要多次洗涤,操作步骤繁杂。Hendrickson等采用异双功能交联剂将DNA链与抗体共价连接。先将5′-氨基末端修饰成含有脂肪胺的多聚核苷酸与N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸盐(SATA)反应,生成乙酰硫代乙酰化多聚核苷酸。则抗体与磺基琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺乙基)环己烷-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)反应,修饰成含有马来酰亚胺的抗体。然后将两种反应物混合,加入羟胺盐酸盐启动反应,由N-乙基马来酰亚胺终止反应,最后生成共价联结的抗体-多聚核苷酸。在免疫PCR中使用这种标记方法,不仅可以减少洗涤微量板的次数,简化操作步骤,并可在同一实验中一次检测多种抗原。

研究者用此法将包含相同引物序列的不同大小的多聚核苷酸片段分别标记到抗β-半乳糖苷酶抗体(antiβ-Gal-55 bases)、抗人促甲状腺激素抗体(anti-hTSH-85 bases)和抗人绒毛膜促性腺激素抗体(anti-HCG-99 bases)。先将抗hTSH、抗HCG和抗β-Gal抗体包被在微量板上,加入待测样品,最后加入多聚核苷酸标记的抗体,用同一对引物共扩增反应产物,扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行检测。结果显示hTSH、β-Gal和HCG的检测灵敏度分别为10-19mol/L、10-17mol/L和10-17mol/L。

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