核素示踪代谢试验

放射性核素示踪是利用放射性核素或其标记物作为示踪剂，采用口服或静脉注射的方法引入体内，然后从体外采集标本观察示踪物的去向，以了解机体在生理、病理过程中对该物质的吸收、分布、代谢和排泄的异同。放射性核素或其标记物与相应的非标记物的性质在生物体内代谢时所发生的化学变化、免疫学反应和生物学过程是完全相同的，但是有不同的物理性质，即放射性核素可发射出射线，可通过核测量仪器进行测量和定量分析，达到观察被放射性核素所标记物质在活体内代谢过程的目的。

用放射性核素研究物质代谢的示踪试验，除前面平衡实验设计中需要考虑的问题外，还包括以下几个方面。

根据实验目的和测量方式选择示踪物

放射性核素半衰期

所用半衰期过长或过短的核素都不合适。半衰期过短的核素，实验尚未结束，其放射性已衰变过多，导致测量困难；使用半衰期太长的核素，则放射性物质在机体内残留时间太长，对机体不利。实际工作中除考虑核素的物理半衰期外，还要考虑该示踪物在体内的生物半衰期。有些示踪物虽然物理半衰期很长，但在体内停留时间不长（生物半衰期短），同样可安全使用。如¹⁴C的物理半衰期为5000多年，有利于运输和保存，但它的生物半衰期只有十多天。因此，应根据实验周期，同时注意考虑示踪物的物理半衰期和生物半衰期，即该示踪物的有效半衰期。

放射性核素射线类型

一般α粒子很少用于生物示踪试验。γ射线穿透力强，发射此类射线的示踪物样品制备和测量都比较简便，在体外观察示踪物于体内运动规律，则必须使用发射γ射线的核素标记物。发射β射线的核素如³H、¹⁴C、³²P等大多数可以进行核素标记（即以放射性原子替代原来非放射性的相同原子），各种代谢转换的研究多选用发射β射线的核素。

放射化学纯度和比活度

对放射化学纯度的要求是不应有放射性杂质（包括其他放射性核素及同一核素标记的其他化合物或游离的放射性核素），其放射化学纯度应在95%以上，放射化学纯度的降低势必干扰示踪试验的测量结果。由于放射性示踪剂在体内应用过程中都会被大量稀释，并且要求最后制成的样品必须仍能达到测量要求，则起始应用的示踪物比放射活性必须较高。如果比活度太低，为了满足测量要求就需要增加化学量，导致化学量过高而引起示踪试验结果失去生理真实性。另一方面，比活度过高，可能引起被标记的化合物分子受到辐射损伤，亦影响示踪结果。

示踪物用量包括化学用量和核素放射活度

化学量应为示踪量，即尽可能低或者根据实验目的的要求用一定的化学量。放射性活度的确定原则是：使用的放射性测量手段可以较灵敏地测出最后样品的放射性，在达到测量结果准确的条件下，确定最小的放射性活度。具体应用时要考虑不同给予途径时的标记物利用率，其在系统内的稀释程度及分布和廓清特点、实验周期长短、观察方法、测量方法及测量效率等，待测样品所含的放射性活度，为达到测量结果的准确性，最后样品要求测得的最低计数率，用反推法估算需引入的放射性活度：根据被测样品的最低计数率要求，并校正在实验过程中各种影响因素所造成的放射性活度的损失量，计算初始应用的示踪剂量。例如：静脉注射示踪物，被观察的整个组织可摄取该示踪物的量约占引入总量的1%，观察10天，在此期间示踪物从该组织中消失约为初始摄入量的90%，拟取待测样品约为该组织总量的10%，测量最低计数率要求为250cpm，测量仪器的计数效率为50%，于是最少放射性每分钟衰变数（dpm）=250÷50%=500dpm；取样时该组织的总dpm：500÷10%=5000dpm；初始时该组织的总dpm：5000÷（100%-90%）=5×10⁶dpm；初始应引入的示踪量：5×10⁶÷60=83.3kBq。

如果采用口服的方式还要考虑示踪物的吸收率（由摄入量、吸收效率和示踪剂通过胃肠的速度等因素决定）。

放射性核素有单标记和双标记两种

核素经口服或（和）静脉注射，然后留取血、尿或粪标本，测定标本中的核素量，通过计算了解物质的代谢状况。常用的放射性核素有¹⁵O、¹³N、¹⁴C、⁴⁵Ca、⁴⁷Ca、²⁸Mg、⁶⁵Zn、⁵⁹Fe和⁵⁵Fe。现列举测定钙吸收的几种方法。⁴⁵Ca释放β射线（半衰期165天），⁴⁷Ca可释放β和γ射线（半衰期4.7天）。

单标法

受试者隔夜空腹，口服一种放射性核素5μCi ⁴⁵Ca（20mg的⁴⁵CaCl溶于250ml蒸馏水），1小时后抽血，离心，采用液闪仪测定血浆中的核素活性（Fx/L），乘以体重的15%，求得1小时在血浆和细胞外液中的理想量（FC），或用Nordin提出的公式：FC=Fx/10L-［15.4×（1/体重-0.0154）］，然后套入经验公式：每小时吸收率=1.17FC+2.54 FC²。该法简便、快速，价格低廉。Nordin等应用该技术在甲旁亢和肾结石的患者中发现钙吸收增加，骨软化和肾衰患者钙吸收下降，正常人和骨质疏松症患者钙吸收与血中降钙素水平相关。髋部骨折的妇女钙吸收低下。用1α-羟维生素D₃治疗后，钙吸收增加。

双标法

较单标法更精确，可得到更多的资料。受试者隔夜空腹，在早餐结束时服用一种核素，之后静脉注射另一种核素，3～5分钟内注完。在6、12、30、45、60、120、240、480分钟抽血，留6、12或24小时尿。通过测量、计算血或尿中的两种核素比确定吸收率。用⁴⁷Ca和⁴⁵Ca需要花费的时间较长，约6～8周。这是由于⁴⁷Ca和其产物⁴⁷Sc可干扰⁴⁵Ca活性的测量，因此，必须待⁴⁷Ca和⁴⁷Sc自动减少后，才可确定⁴⁵Ca活性。为缩短时间，De Grazia等提出同时在标准和样本中沉淀Ca，保持Sc的比例相同，这样可只测β/γ率，得出钙吸收率。有学者则用⁸⁵Sr替代⁴⁵Ca作为静脉注射示踪物，而用⁴⁷Ca口服，因为Sr的血流动力学在3～10小时与Ca相同。Griessen等提出先在Sc通道测量⁴⁷Ca的γ活性，比上用Ca通道所测γ活性。计算⁴⁷Sc和⁴⁷Ca的比率，得出纯⁴⁷Ca量，然后求得⁴⁷Ca与⁴⁵Ca之比。

核素稀释法

核素稀释法是根据化学物质在被稀释前后其质量不变的原理建立起来的。如已知放射性活度为S₁，质量为M₁的标记物和未知质量M_x的同一种化学形式的非标记物充分混匀后，标记物被非标记物所稀释，测混合物的比放射活性S₂必然比S₁低，但是稀释前后的放射性总活度相等，即：S₁×M₁=S₂×（M₁+M₂）。因为混匀后比放射活性S₂保持恒定，不随取量的多少而变化，测定时只要取出部分样品做分离定量，测定其比活度，代入公式中求得待测物质的质量。该方法可以从总的粪便排泄中区分出来自内源性的排泄，计算出物质的真实吸收量（率），已应用于动物中钙、锌、锰、铁、钴等元素的生物利用度的研究。该技术测定钙的生物利用度的方法是：

1. 首先动物进行饲喂方式和时间的适应。
2. 肌内注射适量的⁴⁵Ca，注射液用生理盐水稀释⁴⁵CaCl₂配制而成。用于标记机体内源性钙库，此后出现在粪便中的放射性钙均为内源性钙。
3. 待机体达到平衡后，选择适当的参比组织，如血液，测定比活性（⁴⁵Ca活性/组织中的钙量）。同时测定粪中⁴⁵Ca的活性。
4. 粪便、饲料、血浆、尿液经干灰化法处理后，用原子吸收光谱法测定钙含量。
5. 计算内源性粪钙（endogenous fecal calcium，EFC）：EFC（mg/d）=粪中的⁴⁵Ca的活性（Bq/d）/参比组织的比活性。
6. 计算钙的真实吸收量（率）：真正吸收率（%）=［总钙摄入量-（总的粪钙排出量-EFC）］×100%/总钙摄入量。

放射性核素示踪法灵敏度高，通常可精确测出10^-14～10^-18g的放射性物质，因而对研究微量生物活性物质具有特别价值；放射性核素及其标记物的用量很少，引入后几乎不会改变体内的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状态；测量方法简便，不受其他非放射性物质的干扰及其他物理和化学因素的影响，不必对样品进行复杂的分离和提纯。但应用范围受限；实验过程中可能存在放射生物效应，影响实验结果的准确性；实验操作时，对环境有放射性污染。因此，此法正逐步为稳定核素所替代。

严格防护放射性污染

放射卫生防护包括实验工作人员及实验对象的防护。辐射损伤需一定的剂量，只有在超过最大允许剂量的照射后才对机体有损害。同时应采取必要的防护措施，注意防止不必要的辐射。

动物实验时，除考虑个体动物引入的示踪量，还必须考虑到放射性核素示踪试验与一般理化实验不同，动物接受了放射性核素，即使对个体动物是安全剂量，但动物同时成为辐射源，动物间可相互照射，动物还要排除放射性物质，可污染、照射周围环境。因此，对动物群体饲养和排泄物的处理应采取适当的措施。对操作器具、放射性组织标本、动物尸体及其他放射性废物的处理，应根据具体情况和条件，按照放射卫生防护和废物处理的有关规定进行操作处理。

稳定核素标记是代谢研究的主要方法

稳定核素示踪技术在20世纪20年代已被应用于生命科学的研究，近十余年来，随着稳定核素生产技术的发展以及探测技术的改进，使稳定核素示踪技术被广泛应用。由于它不具有放射性，没有放射生物效应，因此对于临床应用方便，适用于儿童、妊娠及哺乳的妇女；标记的化合物不会衰变，不会辐射和自动裂解，不需要采取防护措施，实验不受时间限制。

稳定核素是同一元素的核素，具有相同的化学性质，它们在有机体内所发生的化学变化和生物学过程完全相同，但与同一种天然元素具有不同的质量，故具有可测量性。稳定核素标记的示踪剂可以应用气相-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）、热离子质谱仪（thermal ionization mass spectrometry）、电感偶合质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、高速原子轰击-继发离子质谱仪（fast atom bombardment-secondary ion mass spectrometry，FAB-SIMS）、磁共振光谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMRS）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）、发射光谱分析法（emission spectrometric analysis）、核素比率质谱仪（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）、气相-核素比率质谱联用法（GC-C-IRMS）等测定方法，计算稳定核素丰度，对标记物质进行定性、定量及定位研究。

通过给予一种（口服）或两种（口服和静脉注射）稳定核素标记的物质，测量该物质所携带的核素量，了解该物质的排泄和体内存留量。这一方法提高了试验的精确性，可了解体内代谢过程。常用的稳定核素有：¹³C、¹⁸O、¹⁵N、⁴²Ca、⁴⁴Ca、⁴⁶Ca、⁴⁸Ca、²⁵Mg、²⁶Mg、⁶⁷Zn、⁷⁰Zn、⁵⁸Fe和⁵⁷Fe。¹³C呼气试验和¹⁵N尿试验是两种常用的方法，既可用于糖、脂肪酸、蛋白质和氨基酸等物质的代谢研究，又可用于临床多种代谢疾病的诊断。缺点是所需的试验条件较高。目前某些物质（如锰）还不能找到相应的稳定核素。

¹³CO₂呼气试验

¹³C标记的化合物在体内被氧化为¹³CO₂，通过测定一定时间内呼气中¹³CO₂/CO₂比值的变化，了解某一化合物在体内的代谢过程。它具有方便、无创伤等优点，但由于呼气中的¹³CO₂被体内大量的CO₂所稀释，丰度不高，需要灵敏的检测仪器。步骤如下：

1. 受试者应禁食12小时，避免对本底¹³C的影响。
2. 收集试验日的一次呼气样品，然后摄入¹³C-标记物。摄入量应根据标记物的核素丰度、标记物在体内吸收和氧化的速率、分析仪的精度确定。
3. 摄入¹³C-标记物后，每间隔10～30分钟收集一次呼气样品。
4. 纯化呼气样品。
5. 测定结果。

临床应用：

1. ¹³C-葡萄糖诊断糖代谢疾病，可用于诊断儿童糖尿病及药物治疗观察；
2. 1-¹³C-亮氨酸、1-¹³C-苯丙氨酸、¹³C₂-甘氨酸研究氨基酸和蛋白质的体内氧化代谢；
3. ¹³C-乳糖和¹³C-蔗糖可诊断双糖吸收不良；
4. ¹³C-碳酸氢钠用于研究肝脏血浆蛋白的合成；
5. ¹³C-醋酸盐和¹³C-乙醇了解醛脱氢酶缺乏症。

¹⁵N尿试验

含氮物质在体内的代谢产物主要通过尿排泄，检测尿液中的¹⁵N含量，可了解某一物质的代谢过程。这一方法较¹³C呼气试验精确。试验步骤如下：

1. 受试者在实验前需禁食一夜，实验前将尿排空，并留尿样作为本底；
2. 予以¹⁵N-标记物，收集一定时间的尿液，-20℃保存；
3. 根据研究的内容对尿液进行处理；
4. 测量尿液中的¹⁵N丰度，计算结果。

¹⁸O/²H体成分分析与能量消耗分析

受试者饮用富含¹⁸O、²H或两者的核素水后，收集尿与血样，然后与服用核素水前所收集的样品进行比较。根据核素稀释技术的原理，在饮用核素总量已知的情况下，根据被测核素被稀释的情况，可以计算出身体总水的含量。同理，该法亦可用于间接分析体内能量的消耗。临床上可应用于肥胖患者的研究。H₂¹⁸O较贵、测定仪器贵以及有限的精密度和有限的生物半衰期窗宽是制约该法广泛应用的主要原因。