流式细胞仪分选法分离人类X和Y精子

待分选的精子被制备成单个细胞的悬液，经特异性的活体荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室，在充满于流动室中的鞘液约束下，细胞排成单列形成液柱；在由喷嘴喷出时，流动室产生频率为30kHz的机械振动，使液柱断裂成一连串均匀液滴流出，如果液滴中精子特性符合分选特性，则仪器在这个被选定的精子刚形成液滴时充以指定电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依所带电荷向左或右偏转，进入指定的收集器内，完成精子分选。

试剂与器材：

1. Tyrode液；
2. 10mmol/L PBS；
3. HO33342（Hoechst33342，DNA特异性的活体荧光染料）；
4. 2ml聚丙烯试管；
5. 14ml离心管；
6. Epics 753或Epics V型流式细胞仪分选器：专门改进用于精子分选，其前向角散射光检测器被荧光检测器所取代，标准的圆柱状标本注射尖嘴被改制成斜面以产生带状标本细流。

方法：

1. 新鲜液化精液用等量PBS稀释后，取3.0ml左右加入到含有0.25mol/L蔗糖的10mmol/L TrisHCl液（pH7.4）作缓冲的离心管中，室温下400g离心10min，去上清液，并用棉拭子擦去试管壁上黏附的精浆，剩下的精子沉淀用9ml PBS混悬，同上离心后去上清液，最后沉淀用PBS混悬并调精子浓度为20×10⁶/ml；
2. 上述精子悬液用10μmol/L HO33342在35℃条件下孵育1h，使其染上活体荧光染料；
3. 将已染色的精子悬液加入样品管中，以PBS作为鞘液，紫外光（351nm，364nm）作为激发光，通过流式细胞分选器将X和Y精子收集到两个单独的无菌的2ml聚丙烯试管中。

分离效果：Johnson等采用该法分离牛、羊、猪和兔的精子，前三种动物X和Y精子纯度高达90%以上，兔的X和Y精子纯度分别为86%和81%，Johnson等随后又采用该法分离了人的精子，其X和Y精子的纯度分别达到80%和75%以上，并且分选后的精子1h后的活率范围仍为65%～75%，说明人精子没有因染色和细胞分选而出现明显的伤害。目前采用该法分离的牛和兔等动物精子进行人工受精已获成功，并生产出正常后代。