精液细菌、真菌的实验室检查

睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等与精子生成、成熟或运输有关的器官发生感染可影响精子的数量与质量。常见引起生殖道感染的病原体有葡萄球菌、链球菌、肠球菌、肠杆菌科细菌、不动杆菌、乳杆菌、支原体、衣原体、非致病性奈瑟菌、念珠菌、病毒等。可取尿道口分泌物、前列腺按摩液、精液进行检查。

精液细菌、真菌的显微镜直接检查

一、精液标本的收集：按WHO标准，禁欲3～7天，采集前排小便，洗净双手，用0.01%的苯扎溴铵消毒尿道外口，用无菌生理盐水反复冲洗阴茎、阴囊，以手淫法将精液收集于无菌瓶中。

二、显微镜检查：精液、前列腺按摩液进行显微镜检查是检查精液是否染菌最常用的方法。

精液涂片、固定、革兰染色镜检：

1. 革兰染色原理：革兰染色的结果取决于细菌细胞壁的结构：①G⁺菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。②G^-菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
2. 试剂：①结晶紫（crystal violet）液：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸铵水溶液80ml，将两液混匀置24小时后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。②碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300ml即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。③95%乙醇。④稀释苯酚复红溶液：碱性复红乙醇饱和液（碱性复红1g，95%乙醇10ml，5%苯酚90ml混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液），取苯酚复红饱和液10ml加蒸馏水90ml即成。⑤番红溶液：番红O（safranine，又称沙黄O）2.5g，95%乙醇100ml，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
3. 方法：革兰染色法包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤：①涂片固定；②草酸铵结晶紫染1分钟；③自来水冲洗；④加碘液覆盖涂面染1分钟；⑤水洗，用吸水纸吸去水分；⑥加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分；⑦番红染色液（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
4. 结果：G^-被染成蓝紫色，G⁺被染成淡红色。
5. 注意事项：①新配制的染液应先用已知的G⁺菌和G^-菌作对照，以检查染液质量。②革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，G⁺菌也可被脱色而染成G^-菌；如脱色时间过短，G^-菌也会被染成G⁺菌。

精液的抗酸染色镜检：

1. 抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与苯酚复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
2. 试剂：①苯酚复红液：称碱性复红4g，溶于95%乙醇100ml内，即成碱性复红饱和乙醇溶液。取该饱和溶液10ml，与50g/L的苯酚水溶液90ml混匀。②复染液：称亚甲蓝2g，溶于95%乙醇100ml中制成饱和溶液；再取该饱和溶液30ml加入蒸馏水100ml及100g/L的氢氧化钾水溶液0.1ml即成。③脱色液（3%盐酸乙醇）：浓盐酸3ml 加95%乙醇97ml。
3. 方法：夹住精液涂片，滴加苯酚复红染色，加温至有蒸汽出现，勿煮沸；染5分钟，流水冲洗，3%盐酸乙醇脱色；水洗后，亚甲蓝复染1分钟；水洗，干后，油镜检查。
4. 结果：红色为抗酸性细菌，蓝色为非抗酸性细菌或细胞。
5. 注意事项：苯酚复红加温染色过程中，温度不宜过高，勿使染料蒸干。

精液细菌、真菌的培养

常用细菌培养基

一、 血液琼脂（血平板）

1. 成分：普通营养琼脂95ml，脱纤维羊血（或兔血）5ml。
2. 配制：将已灭菌的普通营养琼脂（pH为7.6）加热熔化，冷却至50℃左右，以无菌手续加入纤维羊血（临用前置37℃水浴箱预温），轻轻摇匀（勿使有气泡），倾注于灭菌平皿内，每一平皿（直径9cm）20ml或分装试管，等凝固后，抽样置35℃培养，18～24小时，观察有无细菌生长，如无细菌生长，置4℃备用。

二、 巧克力色血琼脂（分离嗜血杆菌用）

1. 成分：氯化钠2.5g，蛋白胨5.0g，牛肉粉2.5g，酵母浸膏2.5g，蒸馏水500ml（以上成分亦可用营养琼脂或哥伦比亚琼脂），氯化血红素15mg，25mg/ml万古霉素，7.5g/L辅酶A（NAD）。
2. 配制：称取上述成分后，加蒸馏水溶解，用少量0.25mol/L氢氧化钠溶解氯化血红素后加入培养基，调pH7.8，高压灭菌，至60℃左右加入30ml羊血，置85℃水浴中摇动10～15分钟，冷至50℃左右加入上述浓度万古霉素、NAD各1ml。摇匀后倾注平板，抽样做无菌实验后，4℃保存备用。

三、麦康凯琼脂：分离革兰阴性杆菌用。称取麦康凯琼脂，加蒸馏水溶后，高压灭菌，倾注平皿。

四、罗氏培养基（改良）：分离结核分枝杆菌。

1. 成分：谷氨酸钠（99%以上）7.2g，磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁0.6g，甘油12ml，马铃薯淀粉30g，蒸馏水600ml，新鲜全蛋液1000ml，2%孔雀绿水溶液20ml。
2. 配制：①基础液制备：量取蒸馏水600ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和甘油，沸水浴使其溶解，自然冷却。②新鲜全蛋液制备：洗净新鲜鸡蛋表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20～30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡蛋液，搅匀。通过消毒的纱布过滤。③将600ml基础液和1000ml新鲜全蛋液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖。

常用真菌培养基

沙保弱培养基：

1. 成分：蛋白胨10g，琼脂20g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。
2. 配制：上述成分混合，加热溶解分装，高压灭菌15分钟，倾注平皿。

念珠菌显色培养基：配制：称取柯玛素显色培养基，加蒸馏水后，高压灭菌，冷至50℃左右倾注平皿。

精液中常见细菌、真菌的鉴定

细菌培养：以无菌技术将待测精液接种于血平板、巧克力平板，或加上麦康凯平板。接种后的培养基置35℃温箱，在分离培养某些细菌（如淋病奈瑟菌）时，需将已接种的培养基置5%～10% CO₂的环境。

1. 淋病奈瑟菌：将精液接种于巧克力平板，5%～10% CO₂的环境中35℃培养24～48小时后，取生长的可疑菌落涂片革兰染色，油镜下观察是否为革兰阴性，肾形成双排列，并取可疑菌落做氧化酶、糖发酵实验，并可进一步用荧光抗体实验等鉴定。对初步认定的菌落可先用头孢硝噻吩纸片检测β-内酰胺酶，并做规定的抗生素敏感实验。
2. 革兰阴性杆菌：取平板上分离的纯菌落，革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，按细菌生化鉴定程序操作，并进行药敏实验。
3. 葡萄球菌：根据涂片、染色检查结果作血浆凝固酶、甘露醇发酵实验、耐热核酸酶实验、葡萄球菌A蛋白检测等。
4. 链球菌：根据涂片、染色可见链状排列的革兰阳性菌。血平板培养有助于识别溶血特征，挑选可疑菌落进行血清学分类鉴定、杆菌肽、Optochin等实验鉴定。
5. 厌氧菌培养：按厌氧菌培养的要求收集标本，并立即送厌氧培养。
6. 结核分枝杆菌培养：标本收集后，自行液化接种于罗氏培养基，置35℃培养约2个月，培养期间每周观察结果。发现可疑菌落，作涂片抗酸染色确认。
7. 真菌培养：取精液接种于沙保弱培养基或念珠菌显色培养基进行培养鉴定。