[文献资料]第5节 酪氨酸激酶测定‐活细胞及细胞膜样本32P 标记

使用不含非标记磷酸的培养液进行标记(3～5h)。如果培养液中必须加血清，则应先在HEPES（pH 7 ﹒。2）缓冲液中透析血清24～48h，以去除磷酸根。每毫升溶液中含无载体32P磷酸盐（＞ 3000Ci／mmol）0.5～1mCi。用冰冷的无磷酸盐培养液洗涤一次，或直接将溶胞液（含有抑酶液A，B）0.5～1ml加入培养皿。制备磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。测定酪氨酸磷酸化的反应可在冰浴中进行。最常用的顺序是先将细胞膜和配基混合，孵育10min左右，然后加入标记的ATP再反应一定时间。因此，最好先将细胞膜与一定浓度的非标记配基混合5min，使ATP‐激酶‐磷酸化酶达到一个平衡。然后依次再加标记ATP和激动剂。