病程早期约40%的病例痰、鼻或咽拭子、气管分泌物或胸水接种于Hayflied培养基(主要成分有脑心浸液、马血清等),10天左右可分离出肺炎支原体,但阳性检出率仅10%~50%,且技术条件要求高,临床应用尚有一定困难。约50%的病例血清链球菌GM凝集试验阳性,其凝集素效价为1 ∶ 40或更高。聚合酶链反应(PCR)技术检测有敏感性高、特异性强、简便快速等优点,但需结合抗体滴度等其他检查,才能分析是现有感染、过去感染后病原体在体内持续存在、还是再感染过程中的暂时携带状态。