基因克隆中最主要的工具酶有限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录酶以及DNA连接酶等,这些酶主要从原核细胞中提取。有些限制性内切酶识别序列为8个或8个以上碱基对,如Not Ⅰ,其识别序列为GCGGCCGC,Sf i Ⅰ为GGCCNNNNNGGCC。有些限制性内切酶识别序列不同,但是切割DNA后产生相同的粘性末端,这些酶称为同尾酶(isoaudamer),如BamH Ⅰ(G ↓ GATCC)和Sau3A I(N ↓ GATCN)。包括Taq DNA聚合酶和其他耐高温DNA聚合酶,以及T4多聚核苷酸激酶、RN ......