与分枝杆菌和其他微生物的DNA依赖性RNA多聚酶结合形成稳定的结合物,抑制该酶的活性,从而阻碍细菌的RNA合成,发挥抗菌作用。穿透力强,可进入细胞、结核空洞、痰液及胎儿体内,脑膜炎时脑脊液内药物浓度达血药浓度的20%。在肝内脱乙酰基后仍有活性。利福平的衍生物利福喷丁、利福定抗菌谱同利福平,但抗菌活性更强。