二、连接反应时需要考虑的一些因素

DNA的连接反应是一种说起来简单、做起来不一定顺利的操作过程，需要考虑一些容易忽视的影响因素，并且学会从凝胶成像上估计连接比例的具体用量。应该注意的是：ATP浓度过高可以抑制T4 DNA连接酶的活性，ATP在5mmol/L浓度下可100%抑制平头末端连接和10%抑制黏性末端连接，但ATP浓度过低（如0.1mmol/L）时，去磷酸化的载体容易发生自身环化连接。考虑到T4 DNA连接酶对DNA末端表观Km值约为1.5nmol/L，连接时的DNA总浓度不应低于1nmol/L，应具有2nmol/L的末端浓度（注： ......