两性霉素B作用于真菌细胞膜,与膜中甾醇结合,损伤膜的完整性,使真菌细胞内的一些生理物质(钾离子、核苷酸、氨基酸等)漏失,破坏正常代谢而起抑菌作用。人体细胞膜上也有甾醇,虽其组成与真菌细胞膜的甾醇有所不同,但两性霉素B毕竟是属于毒性较大的一种抗真菌药。