对映体混合物在分离前,先与高光学纯度衍生化试剂反应形成非对映体,然后以常规(偶也见手性)固定相分离,称为间接法,也称手性衍生化试剂法。不同的是手性衍生化试剂法是将其引入分子(溶质)内,而手性流动相添加剂法和手性固定相法则引入分子间。缺点是样品中相关化合物最好预先分离,衍生化手性试剂的光学纯度的要求高以及异构体之间的衍生化反应速率可能不同。其缺点是有时样品也需作柱前衍生化(不一定用手性衍生化试剂),对样品结构有较大限制,价格昂贵,其适用性尚不及普通HPLC固定相。