[速览]（三）连接反应的体系

首先制备目的基因片段和载体。各取DNA1～3 μ l，建立下列反应体系：质粒2 μ l 10 ×缓冲液2 μ l Hind Ⅲ 1 μ l Xho Ⅰ 1 μ l双蒸水20 μ l。将目的基因片段和载体在1.5ml Ep管中建立连接反应:目的基因片段0.4μg载体DNA片段0.1μg 10×缓冲液2μl T4DNA连接酶1μl双蒸水20μl。将连接的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞。若目的基因片段或线性化载体有粘性末端,先将末端补平：质粒0.1μ l 10 × Klenow缓冲液2 μ l Klenow大片段1 μ l 2mmol／L dNTP 1 μ l双蒸水20 μ l。室温2h酚、氯仿抽提,乙醇沉淀，溶于10 μ l TE（pH8 ﹒。16℃, 12～16h将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，并进行克隆筛选鉴定。