由于受试药物的化学结构、活性成分各异,毒性反应的强弱也不尽相同,可根据受试药物的特点,选择适当的实验方法进行试验。当在某一剂量部分动物出现死亡,部分死亡出现在后续的下一个高剂量,此时,MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间,LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。经典半数致死剂量法(LD50)试验方法起源于Trevan的报道,标准方法是应用4~6个剂量,每个剂量10只动物,总共应用80只或更多的动物。此两个缺点在其他替代性急性毒性试验中也存在,如上下法。