介绍双色FISH检测人精子染色体非整倍体的方法，主要包括精液的前期处理、精子核去浓缩、荧光原位杂交、杂交信号判读。
人正常精子为单倍体细胞，含22条常染色体和一个X染色体或Y染色体。若精子染色体数目发生了增多或减少，则被称为非整倍体精子。利用荧光原位杂交技术，即使用带荧光素标记的特异性DNA探针，与靶染色体杂交，在荧光显微镜下观察荧光信号的数目，可判断所检测精子中靶染色体的数目。
试剂：二硫苏糖醇（1，4-Dithiothreitol，DTT），Triton X-100，柠檬酸，甲酰胺，PBS缓冲液，杂交缓冲液（SSC），甲醇，冰乙酸，氯化钾，FISH探针及检测试剂盒等。
一、精子的前期处理
将手淫法获得的精子室温静置至精液完全液化。将液化后的精液标本转移到离心管中，加入两倍于精液体积的PBS缓冲液，1000g离心5min，去上清液。
再逐滴加入75mmol/L氯化钾的低渗液，震荡混匀，置于37℃水浴中30min。1000g离心5min，小心去上清液。逐滴加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1），轻柔混匀，终体积为8ml。1000g离心5min，去上清液，用固定液调整精子悬液到合适浓度。取2～3滴悬液自高处滴到预冷的玻片上。风干，立即进行去凝集步骤，或在-20℃保存。
二、精子核去凝集
由于精子头染色体高度浓缩，增加了精子细胞遗传学研究的难度，精子核去凝集就是打破精子核内精核蛋白的二硫化合物桥，并使精子核肿胀，增加探针的穿透性，提高杂交率。
- 自-20℃取出玻片，置室温10min。在2×SSC中洗2次，每次洗3min，然后依次放入70%、85%、100%乙醇中脱水5min，室温风干。
- 将玻片放入含有5mmol/L DTT和1%Triton X-100的缓冲液中浸泡15～30min。
- 再将玻片在2×SSC中洗2次，每次洗3min，然后依次放入70%、85%、100%乙醇脱水5min，室温风干。
三、精子荧光原位杂交
- 取去凝集后的玻片，用钻石笔在背面标记杂交位置。然后将玻片放入到含70%甲酞胺（formamide）的2×SSC中3～5min变性。然后依次放入70%、85%、100%乙醇中脱水。
- 自-20℃冰箱取出探针（AneuVysion Assay Multi-color Probe Panel：CEP18/X/Y or LSI 13/ 21），解冻后混匀，取探针液10μl加在玻片标记位置，加盖玻片，注意避免有气泡产生，以免影响杂交效果，用封口胶将盖玻片封口，放湿盒37℃杂交6～24h。
- 去除封口膜及盖玻片，为减少非特异性的杂交信号，将玻片放入37℃预热的含0.3%NP-40的0.4×SSC洗液中2min，再放入含0.1%NP-40的2×SSC洗液中，室温1min。
- 在加探针液位置加DAPI 10μl进行复染。盖玻片封杂交区，立即进行信号分析或-20℃保存。
四、杂交信号判读
在荧光显微镜下可见精子头部经DAPI复染后呈蓝色荧光，边缘清楚。每个正常的精子应该有一个蓝的信号（代表18号染色体），一个绿的信号（代表X染色体）或者一个红的信号（代表Y染色体）。如果是13号或者21号染色体探针，在正常精子中只有一个代表信号。
