精子非整倍性染色质检查

介绍双色FISH检测人精子染色体非整倍体的方法,主要包括精液的前期处理、精子核去浓缩、荧光原位杂交、杂交信号判读。

人正常精子为单倍体细胞,含22条常染色体和一个X染色体或Y染色体。若精子染色体数目发生了增多或减少,则被称为非整倍体精子。利用荧光原位杂交技术,即使用带荧光素标记的特异性DNA探针,与靶染色体杂交,在荧光显微镜下观察荧光信号的数目,可判断所检测精子中靶染色体的数目。

试剂:二硫苏糖醇(1,4-Dithiothreitol,DTT),Triton X-100,柠檬酸,甲酰胺,PBS缓冲液,杂交缓冲液(SSC),甲醇,冰乙酸,氯化钾,FISH探针及检测试剂盒等。

一、精子的前期处理

将手淫法获得的精子室温静置至精液完全液化。将液化后的精液标本转移到离心管中,加入两倍于精液体积的PBS缓冲液,1000g离心5min,去上清液。

再逐滴加入75mmol/L氯化钾的低渗液,震荡混匀,置于37℃水浴中30min。1000g离心5min,小心去上清液。逐滴加入固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1),轻柔混匀,终体积为8ml。1000g离心5min,去上清液,用固定液调整精子悬液到合适浓度。取2~3滴悬液自高处滴到预冷的玻片上。风干,立即进行去凝集步骤,或在-20℃保存。

二、精子核去凝集

由于精子头染色体高度浓缩,增加了精子细胞遗传学研究的难度,精子核去凝集就是打破精子核内精核蛋白的二硫化合物桥,并使精子核肿胀,增加探针的穿透性,提高杂交率。

  1. 自-20℃取出玻片,置室温10min。在2×SSC中洗2次,每次洗3min,然后依次放入70%、85%、100%乙醇中脱水5min,室温风干。
  2. 将玻片放入含有5mmol/L DTT和1%Triton X-100的缓冲液中浸泡15~30min。
  3. 再将玻片在2×SSC中洗2次,每次洗3min,然后依次放入70%、85%、100%乙醇脱水5min,室温风干。

三、精子荧光原位杂交

  1. 取去凝集后的玻片,用钻石笔在背面标记杂交位置。然后将玻片放入到含70%甲酞胺(formamide)的2×SSC中3~5min变性。然后依次放入70%、85%、100%乙醇中脱水。
  2. 自-20℃冰箱取出探针(AneuVysion Assay Multi-color Probe Panel:CEP18/X/Y or LSI 13/ 21),解冻后混匀,取探针液10μl加在玻片标记位置,加盖玻片,注意避免有气泡产生,以免影响杂交效果,用封口胶将盖玻片封口,放湿盒37℃杂交6~24h。
  3. 去除封口膜及盖玻片,为减少非特异性的杂交信号,将玻片放入37℃预热的含0.3%NP-40的0.4×SSC洗液中2min,再放入含0.1%NP-40的2×SSC洗液中,室温1min。
  4. 在加探针液位置加DAPI 10μl进行复染。盖玻片封杂交区,立即进行信号分析或-20℃保存。

四、杂交信号判读

在荧光显微镜下可见精子头部经DAPI复染后呈蓝色荧光,边缘清楚。每个正常的精子应该有一个蓝的信号(代表18号染色体),一个绿的信号(代表X染色体)或者一个红的信号(代表Y染色体)。如果是13号或者21号染色体探针,在正常精子中只有一个代表信号。

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