胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)检测技术

目前广泛应用的技术包括单细胞聚合酶链式反应(single cell—single gene polymerase chain reaction)、FISH和比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization-array,CGH array)。大部分实验室选择在胚胎发育第3d进行活检,通常仅有1个卵裂球可用于诊断,而且诊断时间有限(1~2d),因而所有检测技术必须快且敏感度要高。

单细胞PCR

PCR主要是针对已知的单基因突变疾病进行诊断。在进行人工受孕及PGD以前,必须对配偶双方的基因进行详细的分析,确定基因突变的位置,进而选择最适合的标记物(Primer)。由于每个病的基因突变区域并不相同,因此诊断实验室的准备工作时间长,而且复杂。一般只有少数实验室可以进行PCR的诊断。

单细胞PCR有三个重要的因素必须考虑:污染问题、扩增效率问题及等位基因脱落问题。任何单细胞PCR,必须非常小心外源DNA的感染,外源DNA包括精子、颗粒细胞和操作者之DNA。因此操作环境必须非常干净。另外患者必须采取ICSI,以防精子DNA污染。其次,在单细胞PCR反应中,由于只有1~2个卵裂球可用于聚合反应,其扩增效率比常规PCR低5%~10%,因此在聚合反应后,若诊断区域并未扩增,并不表示该卵裂球没有基因突变,有可能是扩增效率低,单体染色体(非整倍体),或是等位基因脱落等问题。等位基因脱落是指两个等位基因中,只有一个等位基因被扩增至可检测到的程度,其发生率约5%~20%,发生原因并不清楚。基于单细胞PCR扩增效率低及等位基因脱落的问题,有可能导致误诊,因此在给患者遗传咨询时,必须小心告知。

针对上述两项问题,可采用多重PCR,增加等位基因的标记物,扩增与目的基因相连的短串联重复序列(Linked Short Tandem Repeat)进行DNA指纹分析,或对目的基因内的单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)进行分析。此方法可同时确定PCR的产物是否来自配偶双方,同时可去除外源DNA的污染问题。新技术如荧光PCR,其反应物带有荧光染料,当反应发生时,荧光染料标记会被释放出来,再加上即时PCR(real time PCR)的侦测技术,其敏感度比普通聚合酶链式反应高出1000倍以上,可侦测出1~2bp基因的差异,因此为单细胞低扩增效率问题提供了解决方法。

FISH

FISH应用于PGD/PGS

FISH是PGD检测常用的手段。这个技术的关键是要有适合的探针(Probe)。探针带有荧光,将卵裂球固定在玻片上与探针杂交后,在荧光显微镜下侦测讯号。广义地说,用于FISH的探针有染色体计数探针(Enumeration Probe)、位点特异性探针(Locus-Specific Probe)和染色体涂抹探针(Whole-Chromosome Painting Probe)。探针一组最多有5个,如染色体X、Y、13、18、21或染色体13、16、18、21、22;每一个探针带有不同的荧光剂,如深蓝、浅蓝、红、绿和金黄。用于PGD的探针是染色体计数探针或位点特异性探针,其原因是第3~5d的卵裂球或滋养层细胞呈现间期核(interphase nuclei)状态,所以在探针的设计上要小,特定性100%,不会产生杂交交叉现象(cross-hybridization),以免造成误诊。染色体涂抹探针,适用于分裂中期(metaphase)的染色体。

基于探针的设计,FISH可用于诊断染色体不正常的患者。如染色体X连锁病(X-linked disease),罗伯逊易位(Robersonian translocation)者,平衡易位(balanced translocation)者及非整倍体筛选(Aneuploidy Screening)。对于X染色体连锁病,如血友病(Hemophilia),最简单的遗传学诊断就是以染色体X、Y为探针,进行胚胎性别诊断。另外由于染色体13、18、21三体(Trisomy13,Trisomy18,Trisomy21)的胚胎有存活的机会,因而临床上常用的探针组是筛选染色体X、Y、13、18、21。对于罗伯逊易位及染色体平衡易位携带者,由于精子和卵子的减数分裂过程中染色体的不平衡分布,导致习惯性流产。这种类型的患者,借助PGD的帮助,可筛选出不平衡的胚胎,植入正常或平衡的胚胎。对于携带罗伯逊易位者,如45,XY,der(13;14)(q10;q10),或是发生在15号、21号、22号染色体的易位,可用位点特异性探针。对于平衡易位者,如46,XX,t(2;5)(p12;q31),可选择次端粒探针(Subtelomere probe),或distal探针(探针位置接近断裂点靠近末端)。一般次端粒探针都很小,因此FISH所需的时间较长。

随着女性年龄的增加,卵母细胞在减数分裂时染色体产生误差的概率也相应增加。这意味着和正常精子受精后,产生三体性和单体性的概率也相对地增加,导致胚胎着床率降低。由于FISH的敏感度高,诊断过程简单且时间短,所以目前至少有一半以上(66%)的FISH检测是用来筛选非整倍体的胚胎。常用的是筛选5~12个染色体的探针组。如针对染色体三体的5个探针组(X,Y,13,18,21)和针对最常导致自然流产的5个探针组(13,16,18,21,22)。另外常用的有9个探针组(X,Y,13,15,16,17,18,21,22),10个探针组(X,Y,8,9,13,15,16,18,21,22)和12个探针组(X,Y,8,13,14,15,16,17,18,20,21,22)可筛选出41%~77%的非整倍性胚胎。杂交反应可多次进行:在第一次杂交反应结束后,可将原有的探针清除,再加上新的探针进行第二次杂交反应,以此类推,进行第三次杂交反应。一般24h内便可有诊断结果。

单细胞FISH的误诊可能性

单细胞FISH的误诊可由下列因素造成:

探针的讯号重叠:比如说,原本是21三体(Trisomy21),但由于两个讯号重叠,结果只显示两个21号染色体。克服的方法是在细胞固定时,细胞核要展开,不可太小。

探针的讯号太弱:其原因可能是多态性(Polymorphism)。多态性对于DNA而言,是一种正常现象。所以如果一个患者大部分的卵裂球的同一个染色体都是单体性,则必须用不同的探针,以避免因多态性造成误诊。

胚胎嵌合型:胚胎嵌合(Mosaic)是指在一个胚胎中,不同的卵裂球具有不同的染色体,其发生率约为20%~50%。从理论上来讲,如果取两个卵裂球做诊断,可降低由胚胎嵌合而导致误诊的风险。但对于第3d活检是否需要常规地取两个卵裂球,目前仍然是一个颇具争议的话题。反对的理由认为,取出两个卵裂球会使胚胎着床率降低约一倍(由18.5%降低到9.5%)。更有研究指出由于胚胎嵌合型造成误诊的概率只有6.8%。还有一种三倍体自我矫正(Trisomy-Rescue)理论,认为在6~8个细胞阶段的三倍体有机会在囊胚期进行自我矫正而变成二倍体。然而这种自我矫正发生的概率非常小,无显著的临床意义。

FISH的实验步骤

  1. 将固定好卵裂球的玻片在相差显微镜下检查每一个卵裂球细胞核是否完整,是否带有微小细胞核(micro-nucleus)。
  2. 将玻片放入70%、80%、100%乙醇/水溶液中各2min。
  3. 室温干燥5min。
  4. 将探针(可自制或购买)放在卵裂球玻片上,盖上一个盖玻片,在盖玻片周围涂上橡皮泥(rubber cement)。
  5. 将玻片放在75~80℃的热板上5min。此步骤是将双链DNA变成单链DNA,以便进行杂交。
  6. 将玻片放在37~42℃的保温箱1.5~4h进行杂交。杂交程序的温度和时间是根据不同种类的探针而改变。
  7. 当杂交程序完成后,将玻片置于室温,除去橡皮泥,然后将玻片放在2倍的SSC/0.3%NP40溶液中(2×SSC=0.3mol/L Sodium Choride+30mmol/L Trisodium Citrate)以便让小玻片自动脱落。
  8. 将玻片放在73~78℃的0.4×SSC~0.7×SSC/0.3%NP40溶液中2~4min。
  9. 将玻片放在2×SSC/0.3%NP40溶液中,室温下1min。
  10. 将玻片放在暗处,室温干燥。
  11. 最后将antifade或是DAPI加在玻片上,盖上小玻片。
  12. 在荧光显微镜下检查探针讯号。

比较基因组杂交

上述提及的FISH技术目前最多可以检查12个染色体。若要检查全部24个染色体,则必须采用比较基因组杂交(Comparative-Genomic Hybridization)。比较基因组杂交方法原则上是结合了PCR和FISH的技术。取出的卵裂球并不放在玻片上,而是直接采用单细胞PCR进行全基因组扩增。接着将扩增后的卵裂球DNA做成探针。另外一组参考探针(Reference DNA Probe)则用正常男性或女性的DNA做成不同荧光剂探针。将检测的卵裂球DNA探针和参考DNA探针做比较,然后做出诊断。

玻片的类型:目前有4种类型的玻片:

  1. Comparative-Genomic Hybridization:玻片上的芯片是正常男性分裂中期(metaphase)的染色体。
  2. BAC-array:玻片上的芯片是全人类基因组的BAC DNA(Bacterial Artificial Chromosome)。
  3. Oligonucleotide array:玻片上的芯片是全人类基因组的寡核苷酸。
  4. Single nucleotide Polymorphism Array:玻片上的芯片是全人类基因组单核苷酸多态性。

实验室步骤:将做好的卵裂球探针和参考探针混合,然后放在选定的玻片上进行杂交反应,最后再以扫描器扫描杂交的结果。如果在某一段染色体上卵裂球探针讯号比参考探针讯号大于1,卵裂球则带有三倍体。若比例小于1,则卵裂球是单倍体。

比较基因组杂交的缺点是所需时间过长。整套操作通常需要数天的时间,使胚胎无法在囊胚期植入,以致冷冻胚胎成为不得已的选择。尽管如此,对于非整倍体筛选,比较基因组杂交仍然不失为未来的方向。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/5356.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学