胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)实验室活检

PGD/PGS检测的前提是对合子和早期的胚胎活检取样。现有的PGD活检方法已相当成熟。大致有三种方法:①极体活检(包括未受精卵和受精卵);②分裂期胚胎活检,通常是指胚胎发育的第3d;③滋养层细胞活检,通常是在胚胎发育的第5d或者第6d进行。

无论是上述三种方法的哪一种,活检程序都包括以下两个步骤:第一个步骤是穿透透明带,第二个步骤则是取细胞。

穿透透明带可以采用机械的方法,也可以用化学的方法(酸性Tyrode溶液)或者是激光技术。激光技术因具有快速和方便的优点而被众多的实验室所采用。

极体活检

第一和第二极体是卵母细胞减数分裂的产物。第一极体通常出现于排卵后,它的存在标志着卵子的成熟,第二极体则在受精后出现。极体活检可用于和女方起源有关的遗传疾病的诊断,如常染色体显性遗传和X连锁母体携带的疾病的诊断、人类白细胞抗原配对等,但是最多的还是用于PGS。

相对于其他的活检方法,极体活检对胚胎的有害影响最小,因为极体并不是受精或胚胎正常发育所必需的。极体活检的缺点在于,他只能用于和女方起源有关的遗传疾病的诊断以及PGS,而不能用于和男方起源有关的遗传疾病的诊断。需要提及的是,由于第一极体有降解以及遗传物资重组的可能性,因而导致诊断错误风险增加。因为这个缘故,通常极体活检会包括第一和第二极体,以提高诊断的准确性。还要指出的是,相当一部分的非整倍体是在卵裂球期发生的,极体活检会漏诊这一部分来源的非整倍体胚胎。

极体活检的试验室操作要点:

  1. 极体活检可分次进行,即取卵当天活检第一极体,次日活检第二极体;也可以同时进行,通常是在取卵的次日早晨活检第一和第二极体。
  2. 与卵裂球活检不同,极体活检只能用激光或机械的方法在透明带(ZP)上打孔,而不提倡用化学的方法。孔的直径大约10mm,可容活检针穿过即可。
  3. 活检针直径为10~15mm,可以是尖头的,也可以是钝头的。活检的时候,极体理想的位置是12点(下图)。活检针穿过透明带,沿着PVS同行的方向接近极体,然后将极体小心地吸入活检针内。如果发现极体仍然紧密地连接着卵胞质,不易吸入活检针内,表明极体尚未完成extrusion。此时应将卵子放回培养箱内,等待片刻,直到极体完成extrusion,方可进行活检。

 极体活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

极体活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

卵裂期活检(卵裂球活检)

卵裂期活检一般指对受精后第3d的胚胎进行的活检。这时候正常胚胎发育达到了6~8个细胞的阶段。与极体活检比较,卵裂期活检的主要优点是可以检测男女双方的遗传信息。但是,卵裂期的胚胎染色体嵌合(chromosomal mosaicism)的发生率比较高,这是卵裂期活检的主要缺点之一。 这个缺点限制了卵裂期活检运用于PGS。为了减少由染色体嵌合而引起的误诊,有些实验室把卵裂期活检和极体活检相结合,也有人主张一次取两个卵裂球细胞进行活检。相对于囊胚活检,卵裂期活检的另外一个缺点是对检测技术要求比较高(单细胞PCR技术)。虽然具有上述问题,卵裂期活检仍然是目前最为普遍使用的方法。主要的原因是:与极体活检相比,他的适用范围更广泛;而与囊胚活检相比,卵裂期活检后,有比较宽裕的时间来完成诊断,通常不需要冷冻胚胎。

卵裂期活检的试验室操作要点:

  1. 活检选在胚胎发育的第3d上午,一般是在ICSI或IVF68~72h后。此时胚胎在6~8个细胞阶段。活检的卵裂球应含有至少5个细胞。
  2. 由于此阶段的胚胎具有细胞之间联结紧密的特点,选用不含有钙和镁的活检液有助于减少细胞之间的联结,从而有助于活检操作的进行。
  3. 用激光或机械/化学的方法在透明带(ZP)上打一个小孔,直径大约是活检细胞的三分之一。
  4. 一次取1个或2个卵裂球。可以用吸入(aspiration)、机械挤压(extrusion)或液体挤压(flow displacement)的方法(下图)。其中以吸入的活检方法最为常用。
  5. 取出的细胞必须是完整的,细胞核必须是清晰可见。活检过程控制在5min内。
  6. 如果是用于PCR诊断,转移细胞时必须带手套,以避免外源DNA的污染。

 卵裂球活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

卵裂球活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

囊胚活检

虽然卵裂期活检仍然是目前最常用的方法,但由于卵裂期活检存在的缺点(染色体嵌合的高发生率和对检测技术的高要求),使囊胚活检成为一个十分具有吸引力的手段。

囊胚于取卵后第5d开始形成,其特点是内胚层细胞团的形成和滋养层细胞的存在。发育好的囊胚在此阶段已有100个以上的细胞。动物实验证明,在此阶段如取出5个左右的滋养层细胞,对胚胎的发育没有影响。

囊胚活检通常在胚胎发育的第5d或第6d进行。检测手段以PCR为主。胚胎植入的时间则视情形而定:如果第6d就能拿到PGD结果,就可以在当天植入,否则,胚胎需要被冷冻保存到下一个周期植入。

同极体活检和卵裂期活检一样,囊胚活检也有他的缺点。其一是数量的限制:平均只有50%的受精卵能发育到囊胚阶段,这使得活检的胚胎数量大大减少,因而在一定程度上限制了PGD的成功。据文献报道,有高达21%的PGD病例因无发育到囊胚阶段的胚胎,而不得不取消PGD活检。这个数字比卵裂期活检要高出四倍。囊胚活检的另一个缺点是如果不能及时拿到PGD结果,胚胎需要被冷冻保存到下一个周期植入。最后需要提到的是,囊胚活检也存在胚胎染色体嵌合的问题,只是与卵裂期活检相比,其发生率很低。

囊胚活检的试验室操作要点:

  1. 囊胚活检是在胚胎发育的第5d或第6d进行,囊胚必须是质量好的。
  2. 在胚胎发育的第3d,用激光或机械/化学的方法在透明带上打一个小孔,以利于随后第5d活检的进行。近来,也有人把打孔放在胚胎发育的第4d,或是在活检的当天,他们认为这样做,对胚胎的发育影响最小。
  3. 与卵裂期活检不同的是,囊胚活检不需要无钙镁离子的活检液。一般认为,无钙镁离子的活检液会影响此时胚胎的继续发育。
  4. 活检针可为钝头,亦可为尖头,直径为15~20μm。透明带的小孔应该调整到5点钟的位置。取细胞时,应小心地避免内胚层细胞团,用细活检吸管取出5~10滋养层细胞即可(下图)。
  5. 遗传分析是通过PCR或FISH的方法,下节会详细提到。

 囊胚活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

囊胚活检(由美国加州大学旧金山分校IVF实验室提供)

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