胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)细胞固定技术

细胞固定技术是一项非常重要的步骤。固定技术不佳会造成高本底或弱讯号,容易造成误诊。常见的固定方法有甲醇-冰醋酸固定法和Tween-20固定法。这里着重介绍甲醇-冰醋酸固定法要点。

液体的配制:固定技术需要的液体有固定液、低渗溶液和预固定溶液。固定液是3∶1的甲醇∶冰醋酸,必须新鲜配制,配制好后置于冰上。低渗溶液是由1%柠檬酸钠和6mg/ml的牛血清蛋白组成。预固定溶液是用400μl低渗溶液加15μl固定液配成。

玻片的准备:滴一滴固定液在玻片表面(预处理玻片),待其挥发后,用钻石笔在玻片上预先画好圆圈。圆圈通常不超过6个,总面积控制在一个盖玻片的范围内。

固定步骤:

  1. 将活检得到的卵裂球在上述400μl低渗溶液中放置5ml,然后转移到上述配制好的预固定溶液中,直到他变成深色(一般为15s到1min)。
  2. 将细胞转移到玻片上预先画好的圆圈内并吸出多余的预固定溶液。
  3. 以下的步骤十分关键,必须把握好时机:吸出多余的预固定溶液后,细胞周边的液体开始蒸发干燥。在液体完全蒸发前一瞬间,添加第一滴固定液。随着添加的固定液的蒸发,细胞开始发光明亮,整个细胞会慢慢扩大。在细胞到达亮度高峰的一瞬间,加两滴的固定液。随着固定液的蒸发,细胞开始再次发光而且体积增大。在到达最大亮度点时,胞质膜骤然破裂,细胞质慢慢开始溶解。
  4. 添加一滴固定液,以利于清除所有细胞质碎片。
  5. 待玻片完全干燥后,用钻石笔在玻片上标上所固定细胞的序号。

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