辅助孵化技术

辅助孵化技术(assisted hatching,AH)是指在体外受精形成的胚胎植入到宫腔之前,人为地在透明带上打洞或使透明带变薄,或使透明带溶解消失,以期达到帮助胚胎孵化促进胚胎植入的目的。

透明带是环绕在卵细胞外的一种非细胞结构,其主要组成为糖蛋白。在结构上透明带分为两层,一层是比较厚而易于穿透的外层,一层是比较薄但不易被穿透的内层。透明带在卵子受精至胚胎早期发育这一复杂的过程中起着重要作用。例如透明带作为一种物理屏障,保护卵子和胚胎免遭外来有害物的侵袭;在受精过程中通过受体协助精子穿入,同时在精子进入之后通过自身结构的改变,阻碍其他精子进入,从而防止多精子受精引起的异常受精卵;受精后,由于透明带的存在,使得不断进行分裂的胚胎保持结构上的完整性。如果人为地去除发育早期胚胎的透明带,胚胎的发育似乎受影响不大,但存活率明显降低。

正常生理情况下,透明带在胚胎进行第一次或第二次有丝分裂时开始逐渐变薄,到晚期囊胚期,透明带已薄到极易被突破的程度。在多种物理及生化因素作用下,晚期囊胚最终突破透明带,从中完全逸出(这一过程被称之为孵化),准备植入子宫内。如果由于某种原因,胚胎不能完成孵化过程,则无法植入子宫内,导致妊娠失败。

在体外受精的临床实践中,人们观察到:经过体外培养后的卵母细胞,在体外受精形成胚胎之后,弹性降低。同时来自于年龄较大女性的卵子,在体外授精形成胚胎之后,其透明带硬度较高。这种透明带硬度改变的现象,可能是造成一部分胚胎在移植回子宫后,不能成功地植入内膜,导致着床失败的原因之一。

辅助孵化的由来及依据

最早提出辅助孵化概念的是Jacques Cohen。他认为:在IVF-ET过程中,胚胎不能从透明带中孵化出来,是造成胚胎植入失败高的原因之一。如果对体外受精的胚胎进行辅助孵化(即人为地在透明带上开口,或使其变薄),将有助于提高胚胎的植入率。他们的依据是:①无论是人或者老鼠的胚胎经过辅助孵化的显微手术后,胚胎开始孵化的时间和孵化的形态学特征都会发生改变,说明辅助孵化的显微手术对胚胎的孵化过程确实可造成影响;②人为地在透明带上开口之后,胚胎的植入率提高。可能是因为辅助孵化增加了胚胎吻合子宫内膜植入窗口开放的机会;③透明带较薄的胚胎易于植入;④任何影响孵化的因素都会导致胚胎孵化过程的延误和缺失,致使植入失败。

1991年Cohen的实验室使用酸化的方法对人类体外培养胚胎成功地进行了辅助孵化。经过辅助孵化之后的胚胎,其植入率虽然有所改善,但与对照组相比,并无统计学上的差异。进一步的观察和分析表明:辅助孵化并不是对所有的患者和所有的胚胎都有提高植入率的作用,而仅是对于那些因某种原因导致自身孵化困难的胚胎有帮助,如透明带过厚的胚胎,透明带异常的胚胎,年龄偏大的患者,和FSH水平过高的患者等。由此,产生了选择性辅助孵化的概念。即根据母体以及每个胚胎自身的具体情况,选择自身孵化困难的胚胎,给予辅助性孵化。

辅助性孵化有助于提高胚胎的植入率,可能是与帮助透明带厚度和硬度异常的胚胎突破机械性屏障,以及帮助质量差而无足够能量完成自身孵化的胚胎突破透明带有关。

辅助孵化的指征

由于辅助孵化并不是对每一个胚胎都有提高植入的作用,为了避免使胚胎暴露于不必要的操作程序和刺激,Cohen根据他的实验室的观察结果,提出了进行辅助孵化的指征。在以后的IVF实践中,其他的IVF中心又对这些指征进行了不断的扩增和补充。虽然不同的IVF中心对指征的掌握有所不同,但总的说来,在决定某个胚胎是否需要进行辅助孵化时,通常考虑的因素包括:患者的年龄、FSH水平、IVF治疗史、胚胎自身质量、胚胎自身发育速度、透明带的厚度、均匀度以及形状。

一、透明带

  1. 透明带的厚度:透明带的厚度大于13μm的胚胎应予辅助性孵化;
  2. 透明带的形状:当胚胎的形状不规则时,如椭圆形,常常提示透明带有某种功能上的缺陷。因此,胚胎形状不规则,通常是需要辅助孵化的指征;
  3. 透明带的颜色:透明带的颜色偏深,如呈现偏棕色或偏深色,应予以辅助性孵化。

二、女性患者年龄

女性患者的年龄是考虑是否需要给予辅助性孵化的一个重要因素。随着女性年龄的增大,其胚胎的透明带通常会变厚、变硬,失去弹性,造成胚胎自然孵化困难。同时,来自女性年龄较大的胚胎,其质量通常较差,也会给胚胎的自然孵化带来困难。有的IVF中心以女性年龄38岁为界,凡年龄38岁或大于38岁,其所有用于ET的胚胎都应给予辅助性孵化。而有的IVF中心是以年龄40岁为界。

三、胚胎的质量:对于质量较差、含有较多碎片的胚胎,其植入的能力通常较差。进行辅助性孵化之后,其植入能力也许有所提高。

四、胚胎的发育速度:发育速度迟缓的胚胎,其自然孵化能力常常减弱,孵化过程常常延迟。辅助性孵化之后,有助于胚胎保持与子宫内膜植入窗口开放时间的一致性。受精后第3d细胞数目仍少于6个的胚胎,经过辅助性孵化后,其植入率高于未经辅助性孵化的对照组。

五、IVF治疗史:对于曾有过IVF治疗失败的患者,应给予辅助性孵化治疗。因为,自然孵化失败很可能是导致他们IVF治疗失败的原因之一。

六、FSH水平:如果在周期的第3d,FSH水平过高(大于15mIU/ml),通常提示卵巢的功能状况较差。这类患者的透明带很可能会因为卵泡发育环境不良而结构异常或功能较差。辅助性孵化常常会提高这类胚胎的植入率。

七、冷冻胚胎:经过冷冻和解冻之后,胚胎的透明带会变硬。因此,冷冻胚胎是辅助性孵化的指征之一。

辅助孵化的方法及其操作

目前有4种辅助孵化的方法:机械法、酸化法、激光法和酶消化法。其中酸化法和机械法在临床上应用广泛,尤其是酸化法;激光法因为需要特殊的设备,在临床上较少使用;酶消化法是近年来出现的一种新方法。据报道,酶消化法对囊胚的植入有明显的帮助,此方法的效果尚待更多的临床实践予以证实。

机械法

机械法在英文中称为partial zona dissection,简称PZD。

一、辅助孵化工作皿的制作 用含有6%Plasmanate(商品化的人类血浆蛋白制剂)的HTF或PBS在Falcon1006皿中做小滴。根据待辅助孵化的胚胎数目决定小滴的数目。每个小滴的体积为10μl;再在小滴上面覆盖4ml左右的经过处理的矿物油(mineral oil);最后盖好皿盖后,将工作皿放入37℃培养箱预热待用,一般需在使用前30min进行预热;

二、显微操作台的准备 将固定针安装在左手边的显微注射针支架上,将PZD针安装在右手边的显微注射针支架上。

三、机械法辅助孵化的操作 其步骤如下:

  1. 将待辅助孵化的胚胎放入工作皿的小滴中,每滴中放1个,一次以放2个胚胎为宜,以免操作时间长,使胚胎过久地暴露于非培养环境中。
  2. 将固定针降入小滴,让卵黄间隙较大的区域处于11点至1点处,在9点钟处用固定针将胚胎固定。
  3. 将PZD针降入小滴,从胚胎的1点钟左右的部位进针,从11点左右的部位穿出。操作时严格避免伤及胚胎的细胞。
  4. 将固定胚胎的固定针放松,从9点钟处移至PZD针之上,用其反复磨擦PZD针,直至透明带被穿透,PZD针脱出透明带,裂隙形成为止。
  5. 将胚胎旋转90°,重复上述操作两次。最终在透明带上形成两条十字交叉的裂隙。

四、将经过辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次,然后放回原培养皿的小滴中或者移植皿中,等待移植。

酸化法

酸化法是指使用Acid Tyrode,s Solution(简称AT Solution)溶解透明带,在透明带上形成一个直径约大于20μm的小洞。

一、辅助孵化工作皿的制作,主要步骤如下:

  1. 用AT溶液在Falcon 1006皿的上方做一个10μl的小滴,用红色记号笔在皿底部将其圈起来,以示区别。
  2. 用含有6%Plasmanate的HTF或PBS在该皿的下部做体积为10μl的小滴。小滴的数目等于待辅助孵化的胚胎的数目。
  3. 在小滴上覆盖4ml左右经过处理的矿物油。
  4. 盖好皿盖后,将工作盘放入37℃培养箱预热待用,一般需在使用前30min进行预热;

二、显微操作台的准备:将固定针安装在左手边的显微注射针支架上,再将另一个固定针安装在右手边的显微注射针支架上,并与嘴吸控制装置(mouth-controlled suction)相连接。

三、酸化辅助孵化的操作,操作步骤为以下两步:

(1)在透明带上打洞:

  1. 将固定针降入AT小滴中,用嘴吸控制装置将AT溶液吸入holding pipette,然后将固定针提出液面。
  2. 用固定针在胚胎的9点钟处将其固定,并使卵黄间隙较大的区域或者碎片较多的区域处于3点钟处。
  3. 将固定针置于胚胎的3点钟处,使用嘴吸控制装置小心地将AT溶液吹在透明带上,使其溶解,固定针在吹入AT溶液的同时,应做轻微的上下移动,使接触AT溶液的透明带范围约200μm。
  4. 一旦透明带被溶解穿透,立即停止吹AT溶液并迅速小心地开始回吸,以对该区域的AT溶液进行清除。
  5. 继续用固定针固定胚胎,同时移动显微镜的载物台,使胚胎离开刚才的工作区域,减少酸与胚胎的接触。

(2)取出碎片:对于含有碎片的胚胎,可利用刚刚在透明带上溶解出来的小洞,使用固定针将碎片吸出。进行此项操作时,严防伤害胚胎细胞或将胚胎细胞误吸出来。

四、酸化后胚胎的清洗:将经过酸化法辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次后,放回原培养皿的液滴中或者移植皿中,等待移植。

酶消化法

近年来,有的IVF中心为了避免酸溶液对胚胎造成的可能性伤害,用Pronase代替AT溶液在局部溶解透明带,以达到辅助孵化的目的。

随着囊胚植入受到越来越多的重视,有的中心采用在植入前将囊胚放入一定浓度的Pronase溶液中培养24h,使得透明带完全被酶消化而消失,以促进囊胚的植入。

激光法

激光AH是通过透明带打孔(openning)、透明带薄化(thinning)和透明带去除等方法,以起到辅助孵化的作用。由于透明带打孔和去除虽可提高孵出率,但其破坏透明带对胚胎的支持、防御、保护功能,而透明带薄化可能由于其薄化既保存了透明带对早期胚胎的上述功能,又削薄了透明带使其易于自然扩张后孵出,因此是目前临床上最常用的方法。许多研究证实了激光法是一种安全有效、操作简便的AH方法。

透明带薄化深度不够不能提高种植率,薄化宽度过小易导致胚胎嵌顿,过大易导致单卵双胎,因此薄化的适宜深度和宽度对提高种植率和减低AH并发症是至关重要的。Blake等采用激光法在透明带外缘气化宽约80μm、深为透明带总厚度50%~80%的薄化区,处理后的胚胎可发生自然薄化,囊胚孵出率明显高于对照组。对第3d胚胎实施完全薄化、薄化一半、薄化1/4的结果显示,薄化1/4临床妊娠率比其他组高。Kung等报道激光对第3d胚胎薄化后囊胚冻融移植,结果临床妊娠率31.4%,种植率达16.9%,取得理想的效果。综上所述,激光AH较理想的区域为:深度应达致密层,约相当于透明带厚度的50%~80%,宽度约相当于总透明带1/4长左右,不同AH方法孵化效果争论不一,有研究比较部分切割术(PZD)、酸化法、激光法和酶消化法4种方法的胚胎种植率,指出4种方法的种植率和妊娠率基本相似,Hsieh等研究则认为激光法的妊娠率和种植率明显优于酸化法。

激光治疗的安全性是人们关注的另一个问题。研究表明:激光辅助孵化是安全的,只要采用适当的方法,其热效应对胚胎的损伤可得到最大程度的避免。激光为透明带AH提供了一种简便、快速、安全的途径。

结束语

辅助孵化对胚胎植入率和妊娠率的改善作用,在许多IVF中心的临床运用中都得到证实。但改善的程度在不同的IVF中心差别很大。这可能与操作人员的经验和熟练程度、所采用的辅助孵化方法以及对患者的选择等相关。

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