精子顶体反应的检查方法

顶体反应的检查方法原理

精子获能后,在一定诱导剂作用下,可立即发生顶体反应(acrosome reaction,AR)。精子在穿过透明带与卵发生融合前,必须经过顶体反应。顶体反应实质上是一种胞吐过程。顶体反应时精子膜和顶体内膜在许多区域发生融合,形成杂合膜颗粒,然后破裂、释放顶体物质,同时也暴露顶体内膜。

通过免疫细胞化学观察发现,早在精子获能阶段,顶体素已从顶体内膜向细胞表面移动,随后溶解其基质并释放出来,释放出来的顶体素附着于精子穿透处的透明带上,说明透明带上有顶体素受体存在。增加细胞外液中的浓度,或体外给予酪蛋白载体(A23187),均可提高细胞内浓度,从而导致顶体反应活力增强,同时伴有顶体素释放增加。由此推论,细胞外浓度是诱发精子获能和顶体反应必不可少的物质。顶体反应是Ca2+依赖性的,因A23187对Mn2+的亲和性强于Ca2+亲和性,A23187诱发顶体反应时,如果在溶液中同时存在Ca2+和Mn2+的话,那么细胞外Ca2+则不能进入精子内,由此不能诱发顶体反应。

用Sr2+、Ba2+、Mg2+代替Ca2+进行人类精子顶体反应试验结果表明,Ba2+、Mg2+不能替代Ca2+在顶体反应中发挥作用,Sr2+虽能诱发顶体反应的发生,却不能有效地促进顶体反应的完成。由此推测,虽然说精子本身缺乏Ca2+,但精子膜上存在Ca2+通道,当Ca2+通道被打开后,精子外的Ca2+进入其内,从而触发了顶体反应。阻断Ca2+通道,顶体反应不能发生。这可能就是精子Ca2+通道被阻断后引起不育的原因。

脂肪酸氧化酶参与了精子的顶体反应,但它并不加强Ca2+的流入,而只是在顶体反应的某些环节发挥调节作用。磷脂酶A参与了人、仓鼠、豚鼠等的顶体反应。在人类精子膜上有人卵透明带ZP3受体分布。G蛋白也具有调节人精子顶体反应的作用。

顶体反应发生后,由于顶体的破裂,膜的丢失,精子形态发生了显著地不可逆转的改变。精子的某些抗原也发生了很大变化,如某些大分子物质的迁移和再分布,某些抗原数量增加,某些抗原的释放和丢失,出现新的抗原等。因而,导致某些单克隆抗体及凝集素在顶体反应前后的精子表面出现不同的定位(表31-3)。

CTC和几种凝集素在AR前后精子的结合位点

CTC和几种凝集素在AR前后精子的结合位点

由于在顶体反应过程中释放的顶体酶作用下,精子便能穿过包裹于卵子外面的卵丘、放射冠和透明带,从而能与卵子的基膜发生接触并形成融合。可见经顶体反应使精子获得了与卵膜融合、使卵子受精的能力。同时不排除获能的精子头部强烈的活动力及楔样作用。

二、检查顶体反应的形态研究方法简述

由于顶体反应在生殖过程中极为重要,检测方法也较多,如豌豆凝集素标记技术、金霉素诱发荧光技术、考马斯亮蓝染色技术、顶体特异性抗精子抗体标记技术等。目前常通过检查精子的顶体反应率,以评价精子的受精能力。

一、透射电镜法

这种检查方法最经典、最客观,适用于所有种属的精子,利用电镜技术可清楚地显示不同阶段的顶体反应的形态结构的变化情况,因此能准确客观地进行评价,但由于操作方法复杂,条件要求较高,故一般来说仅适宜科研。

二、相差和微分干涉相差显影术

这种方法适用于动物实验,亦可用于检查人类精子顶体反应情况,由于顶体极小,故分辨准确性值得注意。

三、重染色技术

重染色技术用于显示顶体反应前后的效果是肯定的。用俾士麦棕加孟加拉玫瑰红显示顶体反应,可见顶体和顶体后区呈现不同的颜色组合,可依此来判断顶体反应阶段和精子存活情况。1981年美国学者Talbot和Chacon用三色法,成功地显示了哺乳动物精子从获能至顶体反应完毕整个过程,效果很好。

四、荧光标记法

研究顶体反应的荧光标记法最常用的是金霉素诱发荧光技术。除此之外,还有其他标记技术。由于顶体反应后,精子表面某些大分子物质发生了较大的变化,如重新定位于某一新区域,原来被掩盖的某些大分子由于顶体酶释放而消失才得以暴露等因素,可利用能与糖基结合的凝集素和/或能与某些抗原分子结合的单克隆抗体等作为探针,检测精子的顶体反应时相和能力。

顶体反应的实验室检测技术

凝集素标记法

一、培养液及试剂

  1. BWW培养液;
  2. 孕酮;

二、待检精液标本的制备

  1. 手淫法留取新鲜精液;
  2. 37℃水浴箱中温育至完全液化;
  3. 精液置于75%Percoll层,250g离心20min;
  4. BWW培养液洗涤,600g离心6min;
  5. BWW培养液悬浮;
  6. 37℃温育5~8h;
  7. 加孕酮(终浓度5mol/L);
  8. 加孕酮前后不同时间点各取0.5ml精子悬液;
  9. 离心,去上清液;
  10. ConA染色。

三、检查前程序(标记技术)

  1. 将上述精子微球充分混匀;
  2. 加1g/ml Hochest33258;
  3. 温育5min;
  4. 装入0.2ml 45%Percoll微量离心管中;
  5. 250g离心6min;
  6. 去上清液;
  7. 加入2ml 4%的多聚甲醛(配制多聚甲醛要边加温边搅拌);
  8. 4℃固定60min(可延至80min);
  9. 350g离心2~4min;
  10. 去上清液;
  11. 将精子微球尽量均匀涂于覆有0.05%多聚赖氨酸玻片上;
  12. 自然干燥;
  13. 用0.2mol/L甘氨酸配加10mmol/L PBS(pH7.4)漂洗;
  14. FITC-ConA染色(浓度为100μg FITC-ConA/ml)25min;
  15. PBS漂洗;
  16. 荧光封固剂封片;
  17. 荧光显微镜检查。

四、结果分析

  1. 顶体完整的活精子不着色;
  2. 发生顶体反应的活精子FITC-ConA着色;
  3. 退化的精子FITC-ConA和Hochest33258均着色;
  4. 死精子Hochest33258着色;
  5. 统计处理四种不同着色类型的精子数。

顶体酶活性测定法(Kenned法)

一、主要试剂:N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯酰胺盐酸盐(Nα-Benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride,DL-NAPNA),二甲基亚砜,Hepes,Triton X-100。

二、试剂与配制

  1. 去污剂缓冲液:0.01%Triton X-100,0.055mol/L Hepes,0.055mol/L NaCl,pH调为8.0,有效期为3d。
  2. 脒盐酸液:0.5mol/L。
  3. 底物液:称取25mg DL-NAPNA,溶于2.5ml二甲基亚砜中。
  4. 底物-去污剂混合液:取22.5ml去污剂缓冲液,与2.5ml底物液混匀。

三、主要设备:分光光度仪,离心机,24℃电热恒温孵化箱。

四、精子顶体酶检测程序

  1. 禁欲3~5d,以手淫或体外排精法收集全部精液于洁净刻度玻璃量杯(密度不超过10ml)中;
  2. 37℃水浴锅中完全液化,充分混匀;
  3. 计数精子浓度,并将其调为2~10×106/ml;
  4. 每份标本同时设检测管和空白管;
  5. 每管参加反应的精子数以3~5×106条为宜;
  6. 采用洗涤、离心、上游法、Percoll分离等技术去除精浆(因为精浆中含有抑制剂);
  7. 将最终精子悬液体积调为100μl,加入100μl脒盐酸液,涡旋振荡混匀;
  8. 每管加入1ml底物-去污剂混合液,24℃孵育3h;
  9. 加入100μl脒盐酸液(对照管不加);
  10. 1000g离心30min;
  11. 收集上清液,分光光度计测定410nm吸光值(OD)。

五、结果计算:在24℃,水解1.0μmol的BAPNA/min的底物量定义为1IU顶体酶活性。顶体酶活性(μIU/106)=(测定管OD值-空白管OD值)×106/1485×精子数(×106

六、判断标准:<48.2μmol/106精子(正常值48.2~218.7μIU/106精子)

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