在受精开始阶段,精子首先必须识别卵子。小鼠的卵子被透明带包围着,是一层具有半透性、半透明、多孔状的糖蛋白,厚约7μm。目前已经知道,它主要由3种糖蛋白组成,按分子量从大到小分别称为mZP1、mZP2、mZP3。许多实验证据表明,精子头部膜表面和透明带表面的糖基互补配对是构成同种精卵特异性结合的分子基础。即在精子膜表面存在着相应于卵子透明带的受体,称为精子膜透明带受体或透明带结合蛋白,在卵透明带上也存在有相应于精子膜受体的配基。现已知道,和精子首先结合的透明带主要是mZP3。83kDa的mZP3含有O-连接和N-连接的寡糖链。在mZP3分子中,具有精卵识别、结合作用的主要功能区是其糖链部分。多数人认为,mZP3被精子识别、结合的是其O-连接寡糖链(分子量约为3.9kDa糖肽)的还原端α-半乳糖残基。但最近有人又证实是其O-连接寡糖链的乙酰葡萄糖胺残基在精卵结合中发挥作用。在精子膜表面有数千个mZP3的结合位点,mZP3与之结合后,能诱发精子顶体反应,使精子得以穿透透明带,进入卵周间隙,接触卵细胞膜。所以,精子识别、结合透明带,关键是识别mZP3。换言之,精子膜表面存在有mZP3受体,mZP3受体和透明带结合是受精开始的决定性阶段。大量研究表明,小鼠精子膜mZP3受体主要有3种,分别为sp56、β-1,4半乳糖苷转移酶、p95。

sp56

应用亲和层析法,人们从小鼠精子膜中分离得到了结合mZP3的56kDa糖蛋白,命名为sp56。sp56具有组织特异性,为睾丸组织所特有。它的mRNA仅见于精子细胞及变态精子。它是一种精子膜外周蛋白,定位于固定后顶体完整的精子头部质膜。在顶体反应过程中,它有再分布现象。受体配基结合实验证实它是mZP3的特异性膜结合位点,并主要与mZP3的O-连接寡糖链相识别和特异性结合,但至今人们未发现sp56含有其他与糖基结合的蛋白质所共有的糖基识别区(carbo-hydrate recognition domain,CRD)。

同源性分析显示,仓鼠精子也含有小鼠的sp56及其mRNA的同源成分;而人及豚鼠精子没有其同源结构。

但是,sp56作为精子膜受体仍有许多问题有待于阐明,如sp56与mZP3结合后能否启动精子顶体反应?作为膜外周蛋白,它如何与信息传导系统发生联系?是否与跨膜蛋白相耦联?等等。

β-1,4半乳糖苷转移酶

β-1,4半乳糖苷转移酶(β-1,4galactosyl transferase,GalTase)能将UDPGal转移至糖链末端GlcNAc或游离GlcNAc生成Gal-GlcNAc。Miller等首先提出GalTase参与小鼠精卵结合,并有以下几方面证据表明GalTase是精子膜mZP3受体。

  1. 等位基因T/t突变的t型精子膜GalTase活性增加4倍,其受精能力也相应增加;而膜GalTase活性未发生变化的突变精子受精能力没有变化;
  2. 活精子头部膜表面有GalTase定位,它能选择性结合于mZP3,但不和mZP1、mZP2发生作用;
  3. α乳白蛋白能与底物GlcNAc竞争性结合GalTase,提高其Km值;当乳白蛋白加至体外受精实验中,精子结合透明带能力受到明显抑制;
  4. 在体外受精实验中,GalTase抗体或GalTase抑制剂或纯化的GalTase可以作为“去能因子”,阻止精卵结合;
  5. 精子膜GalTase表达过量的转基因小鼠,其精子结合mZP3能力显著提高,并对mZP3诱导的顶体反应表现为高度敏感;
  6. 抗GalTase抗体结合于精子膜GalTase后,能激活精子发生顶体反应;而受精的卵细胞得到活化,其释放的N-乙酰葡萄糖胺酶能修饰分子中GalTase结合位点,使精子失去结合受精卵的能力,等等。

尽管如此,GalTase作为精子膜mZP3受体,其种属特异性、组织特异性以及结合后能在多大程度上诱导精子顶体反应等问题还未解决。

p95

p95是采用受体配基结合实验方法,从小鼠精子头部膜蛋白之中分离、鉴定出的分子量为95kDa蛋白质,它具有酪氨酸激酶活性,位于精子顶体区。有大量研究表明p95为小鼠精子膜mZP3受体,或者说至少是mZP3与精子结合的必要成分之一,其主要依据有:

  1. mZP3能激活从精子膜中分离的p95酪氨酸激酶活性,增加其磷酸化程度;同时,mZP3在诱导精子顶体反应时,精子膜顶体区p95酪氨酸磷酸化水平显著升高;
  2. 抗p95单克隆抗体可作为“去能因子”,抑制小鼠精卵结合;
  3. p95具有典型的酪氨酸激酶型受体特征,如配基mZP3可激活精子膜p95双聚化,激活其自身酪氨酸磷酸化,从而诱导精子发生顶体反应;
  4. 酪氨酸激酶抑制剂genistein通过抑制p95活性而抑制了mZP3诱导的获能精子顶体反应。

但是,要确定p95是精子膜mZP3受体地位,还要阐明p95的分子特征和其基因结构;需要比较mZP3是否能与p95转染细胞结合并激活其生物学活性;需要研究p95基因敲除动物精子是否失去结合mZP3的能力等等。

此外,20世纪80年代人们在猪精浆中发现了一种具有相似结构(含有CUB结构域)和相似功能的12~16kDa糖蛋白家族——精子黏附素(spermadherins)家族,包括AQN-1、AQN-3、AWN,家族内糖蛋白之间同源性高达60%。精子黏附素主要由精囊腺分泌,附睾尾部也有较高表达。尽管精子黏附素分子没有CRD同源序列,但它们仍有广泛的糖基结合能力。目前已知道,精子黏附素能识别糖蛋白的O-连接及N-连接寡糖链的Galβ(1-3)-GalNAc、Galβ(1-4)-GlcNAc糖基,并且与其有较高亲和力;精子黏附素能以阳离子依赖方式结合透明带,kDa达nmol/L水平。间接免疫荧光研究证实,精子黏附素结合于经附睾移行后的精子头部顶体区,成为精子膜外周蛋白,获能前这些糖蛋白覆盖于顶体区形成保护衣,以防精子不适时的顶体反应;获能后大部分精子黏附素丢失,留下部分与精子膜磷脂共价结合的黏附素,这些黏附素是精子识别、结合于猪透明带的第一受体。体外受精实验也显示,预先与精子黏附素孵育的未受精卵,其精卵结合能力被抑制。上述结果表明,精子黏附素可能为猪精子膜透明带受体。目前,研究者在马、牛、兔精液中及其精子膜表面也发现了猪精子黏附素的同源物。

综上所述,关于精子膜mZP3受体的实验,不同的实验室常有不同甚至是相互矛盾的结果。这可能与他们的实验方法有关,也充分表明了精子和卵透明带结合研究的艰巨性。另外,和透明带识别、结合的精子膜受体,相对于同一种透明带蛋白,并非只有一种精子膜受体,而是有多种,这一方面说明精子、透明带的相互作用涉及多因子、多步骤而十分复杂,另一方面也表明透明带分子中的多种糖基可能同时识别、结合于不同的精子膜受体而启动精卵结合;就不同种动物而言,精子膜受体之间同源性低、差异大,而透明带同源性高、差异小,这一方面表明精卵透明带结合在进化上并非保守,至少精子膜受体如此,另一方面也可能只是我们能认识的蛋白骨架部分不保守,而我们不了解的糖链部分相似性大,精卵结合过程中又恰恰是糖链部分发挥重要作用,这样精卵结合在进化上仍是保守的。

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