精子获能的检查

检查精子获能方法的理论依据

精子获能,又可称为精子在女性生殖道内的成熟过程。这一成熟过程与精子在附睾内的生理成熟存在着某些质和量的差异。获能这一术语特指精子代谢活化的过程。这一过程涉及:①去除精浆包被成分;②膜流动性和离子通透性增强;③钙离子的内流;④高度活化诱发顶体反应。这是生殖调节研究的关键,因为只有获能的精子才具有顶体反应的能力,而如果顶体反应在获能之前发生的话,那么这将是一条避孕良好途径。在本书有关章节已介绍了有关精子获能的内容,有助于对本节内容的理解和操作程序的应用。

在精子获能时,其膜上cAMP受体在子宫液中高浓度cAMP的作用下,使精子代谢活动明显增强,并使顶体膜不稳定性增加,而输卵管液中cAMP含量较高,可使精子释放顶体水解酶,同时,精子膜上游离的表面活性基团-SH和NH2减少,而ATP酶被激活,表面电荷下降。又由于活精肽作用于活精肽受体,加速了Na+的进入和H+的排出,使细胞内pH增高,并加速精子呼吸率,精子内cAMP和cGMP浓度呈持续性增高状态而致精子活力加强。凝集素是一类能与糖基发生特异性结合的蛋白质,所以常用凝集素作为分子探针去检测结合在糖蛋白或糖脂分子上的各种糖基。用凝集素研究结果表明,获能后的精子从头部开始刀豆蛋白A(ConA)结合量逐渐下降,麦芽凝集素和ConA受体从顶体向后移至精子中段和尾部。精子膜内的嵌入蛋白运动受到抑制,这类蛋白质的修饰导致膜上糖蛋白密集区和稀疏区呈块状分布。

在精子表面分布着雌激素受体,雌激素具有改变精子膜结构而使之对底物的通透性与利用率增加的作用,同时雌激素通过受体介导进入精子核后与DNA特定位点结合,使精子基因在受精后开始表达。

为了更深入地研究精子获能的机制,需要深入地研究精子在获能过程中的调节因素,但目前有关调节因素并不十分清楚。以往研究表明,蛋白激酶C具有刺激精子获能和增强相对分子质量为57 500的精子磷蛋白的作用。表皮生长因子也具有促进精子获能的作用,其作用机制与酪氨酸蛋白激酶的活性有关,即调节蛋白质磷酸化反应。

精子获能的最后阶段,即可在电镜下观察到它深深地陷入卵泡细胞,并被卵泡细胞的微绒毛所包围,卵泡细胞再对精子进行加工。在这种情况下,卵泡细胞产生的糖基转移酶起重要作用。

透明带糖蛋白ZP中的多糖残基与精子表面互补性ZP结合蛋白的结合,在受精期间配子细胞的相互作用中起决定性作用。精子表面ZP结合蛋白对ZP的结合表现在植物血凝素样或酶样物质与底物的亲和性。单体岩藻糖抑制大鼠和豚鼠精卵细胞的相互作用,多聚岩藻糖处理后的人精子与透明带的结合受到抑制。这种现象是否是因为多聚岩藻糖中硫原子所带的负电荷介导了与精子表面的结合,还是精子表面识别糖链中岩藻糖残基的作用尚不完全清楚。有学者用荧光素标记牛血清白蛋白、岩藻糖酰化牛血清白蛋白和水解人透明带蛋白对新鲜人精子的作用,结果显示,在B2介质中培养的经洗涤离心的精子30min后,加入岩藻糖酰化牛血清白蛋白荧光素结合物,继续培养后,经洗涤精子涂片中可见部分精子头部有极醒目的荧光着色。由顶体染色确认岩藻糖酰化牛血清白蛋白荧光素结合物,荧光着色阳性区域位于完整活精子的顶体区。

用鼠单克隆抗体(顶体外膜特异性)及标记抗鼠IgG证明了结合岩藻糖酰化牛血清白蛋白荧光素结合物(Fuc-BSA)的精子属于顶体反应前的精子。这类精子结合荧光标记的牛血清白蛋白,在精子Fuc-BSA培养液中加入不同浓度的人透明带水解酶,用流式细胞仪计数检测,证明溶解人透明带蛋白对精子与标记了Fuc-BSA的结合表现出明显的剂量依赖性竞争性抑制作用,而去透明带卵细胞匀浆不表现这种抑制作用。由于只有顶体反应前的活化精子能够具有Fuc-BSA结合能力,ZP水解物能够竞争性抑制这种结合。故此结果提示,人精子某一亚群带有Fuc-BSA结合位点,这种结合的生物学意义可能在于其参与了精子与透明带的结合。

精子获能检查方法

前已述及,精子获能实际上是精子膜功能状况的表达过程。由此而促使人们努力去探索检查精子获能的客观评价方法。就一些检查方法比较而言,以金霉素(CTC)诱发荧光技术较简便、经济、周期短,而且效果可靠。

精液标本的制备

  1. 禁欲3~5d;
  2. 以电动按摩器或手淫方法采集标本;
  3. 标本在37℃水浴箱中温育至完全液化;
  4. 精液与BWW培养液按1∶2比例充分混匀;
  5. 600r/min离心10min;
  6. 取上清液;
  7. 加2ml BWW培养液;
  8. 离心取上清液;
  9. 静置30min。

CTC诱发荧光工作液(pH7.8±0.05)的配制

  1. 500μmol/L HCl-CTC缓冲液;
  2. 20mmol/L Tris液;
  3. 130mmol/L NaCl;
  4. 5mmol/L半胱氨酸液。

这种工作液必须在4℃条件下避光保存。

操作程序

  1. 5μl处理好的精液;
  2. 均匀涂片;
  3. 37℃温育;
  4. 5μl CTC工作液滴于玻片上;
  5. 加入1mol/L Tris缓冲液配制而成的1.25%戊二醛0.05ml;
  6. 玻片置室温中(避光、避免污染)3~12h;
  7. 荧光封固剂封片;
  8. 405nm荧光滤片的汞灯,大于500nm波长下观察400条精子,510nm保护性滤片;
  9. 计数400条精子中荧光标记数(%)。

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