精子-宫颈黏液相互作用的检查

宫颈及宫颈分泌物与精子功能的关系

人类宫颈为厚壁圆柱体结构,并逐渐向宫颈口缩小。宫颈内膜黏膜上隐窝簇聚,类似腺体。隐窝由宫颈黏膜柱状上皮囊组成。隐窝可以横向、直向或斜向,他们可分叉或向下延伸,却不互相交叉。宫颈隐窝结构随年龄、疾病及月经周期而改变。

粗略地说,与宫颈黏液关系密切的细胞分为三类:纤毛细胞、储备细胞、分泌细胞。宫颈上皮含有不同类型的分泌细胞,在宫颈的不同部位,这些分泌细胞的嗜色性以及分泌颗粒的丰富程度是不同的。这些细胞的分泌物构成宫颈黏液的丰富度。黏液分泌量取决于细胞的分泌活性及其对循环激素的反应,即宫颈黏液的分泌主要受卵巢激素的调节。17β-雌二醇刺激产生大量的水性黏液,而孕酮则抑制上皮细胞的分泌活性,宫颈黏液的分泌量呈周期性变化。正常育龄妇女每天黏液的分泌量在月经周期的中期为500μl,而在周期的其他时期则可能不到100μl。宫颈黏液中有少量的子宫内膜液和输卵管液,还可能含有卵泡液。另外,黏液中有来自子宫和宫颈上皮的细胞和细胞碎片。因此,宫颈黏液是含水分超过90%的非均质性分泌物。表现出一系列诸如黏稠度、成丝性和羊齿化的流变学特征。

受宫颈黏液的分子排列、蛋白质和离子浓度的影响,黏液的黏稠度从经期前的高度黏稠(通常是细胞型),到快要排卵前的月经中期的水样黏稠。在完成排卵之后,黏液的黏稠度又开始再次升高。已如上述,宫颈黏液为一种水性凝胶物质,为高“黏性”成分和含电解质、有机物及可溶性蛋白质成分低的“黏性”成分的组合。构成高“黏性”成分的是黏蛋白的大分子网,决定着黏液的流变学性质。总之,宫颈黏液主要由组成肽核的一些亚单位和低聚糖侧链所构成。

宫颈黏液组成成分的周期性变化可能对精子的穿透力和存活能力有影响。精子对宫颈黏液的穿透大约在正常周期的第9d开始,此后其穿透能力逐渐增强而于排卵前达高峰。随后精子穿透能力开始减弱,这种变化甚至在黏液的性质发生较大变化时也很明显。精子穿透能力在时间和程度上的个体差异很常见。活动的精子在体内以宫颈黏液的纤维丝为导向而到达宫颈隐窝,并在此处停留,然后以缓慢的速度释放入子宫和输卵管。

黏液中的精子总是悬浮在液体介质之中。黏液的pH范围为4.0~8.0。精子对宫颈黏液pH的变化甚为敏感。酸性黏液可使精子失活,而碱性黏液可使其活力增强。但碱性过强(pH 8.5以上)则对精子存活不利。精子在宫颈黏液中游动和生存的最适pH为7.0~8.5,这也是周期中期时宫颈黏液pH的正常范围。然而,当pH为6~7时精子仍能穿透。

由于人们已知宫颈及其分泌物可能具备以下特征:

  1. 排卵期或接近排卵期时利于精子穿透,而在其他时期干扰其穿透;
  2. 保护精子免受吞噬;
  3. 补充精子的所需能量;
  4. 滤过效应(即根据精子活力不同选择精子);
  5. 精子贮留处;
  6. 精子获能的部位。

所以说,精子与女性生殖道分泌物的相互作用对于精子的生存和功能至关重要。

精子-宫颈黏液相互作用检查法

体内试验

一、时间的选择

性交后试验应尽可能紧靠排卵期进行。排卵期可根据通常的临床指标,即月经的周期长短、基础体温、宫颈黏液变化和阴道细胞学检查。如有可能,也应测定血浆或尿中的雌激素水平及进行卵巢超声检查来确定。嘱每对夫妇于试验前两天避免性生活。重要的是要使性交后试验评价宫颈黏液的时间标准化,这一时间应是9~24h内。若条件许可,也可在性交后1、3、5、7和9h进行,这样便于观察其动态变化。

二、试验技术

选择不加润滑剂的窥阴器放入阴道,再用结核菌素注射器(不带针头)、吸管或聚乙烯管在阴道后穹隆部吸取混合标本。然后再用另一注射器或导管吸取宫颈腔中的黏液标本,并迅速地将这些标本置于载玻片上,盖上盖玻片,在光学显微镜下检查。压制标本的标准厚度可用硅胶浸渍过直径为100μm的玻璃微球支撑控制。这样做可以使测定黏液中的精子浓度标准化。

三、阴道混合标本

通常精子在阴道内2h即死亡。检查阴道混合标本的目的在于证实精液确系曾存留于阴道内。

四、宫颈黏液标本

宫颈管下部的精子数目随性交后时间的推移而改变。在性交后2~3h内,宫颈管下部积聚大量精子。

宫颈黏液中的精子活力分级问题,可以依据世界卫生组织(WHO)以前(1999年)规定的标准,即:

  1. a级:快速直线前向运动;
  2. b级:缓慢或呆滞的前向运动;
  3. c级:非前向性运动;
  4. d级:不活动精子。

五、结果的评价

正常妇女在周期中期与精液指标正常的男性性交后9~24h内,宫颈内黏液在每高倍视野(HPF,×400)通常有50个以上的活动精子,其活力属于a、b两级,即相当于2500条以上精子/mm3。每高倍视野中有20或更多的“a”级前向运动的精子即可认为结果良好。如每高倍视野中活动良好精子数不足10条(<500mm3),特别是只有缓慢或转圈的“b”级精子,则表现精子穿透能力减弱或宫颈黏液异常。

性交后试验的目的不仅是为了测定宫颈黏液中的活精子数量,而更重要的是确定性交后一定时间内精子存活率和运动情况。

体外试验

一、方法

将一滴宫颈黏液置于载玻片上,用盖玻片(22mm×22mm)铺平。玻片之间的标准厚度用硅化的100mm玻璃微球来控制。载玻片两侧各滴1滴精液。使与盖玻片边缘接触,借毛细作用精液移向盖玻片下,这样就在宫颈黏液和精液之间出现一清晰的接触界面,该玻片置于湿润的温箱中,37℃温育30min。数分钟内,精液在接触界面处形成一些指状突起伸入黏液。大多数精子在穿透黏液前,先穿过指状突起通道。在很多情况下,似乎是一个为首的精子引导一纵列精子进入黏液。一旦进入宫颈黏液,精子群便呈扇形散开,并随意游动。其中有些精子返回精浆层,大多数都继续向宫颈黏液深处游动,直至遇到细胞碎片或者细胞的阻力才停止前进。有种现象值得提出以供讨论,即如一个为首的精子一旦接触到宫颈黏液,即刻发生不游动的同时,会发生头尾方位的改变,此时,精子群即会全部发生返游。什么原因造成的这种现象,却不清楚。应该承认,这种玻片法试验结果常带有一定的主观性。故本试验只能作为定性地评估精子-黏液相互作用结果。

二、结果评价

本试验几项有参考价值的指标:

  1. a.精子穿透黏液,并有90%以上具有明显直线运动的活精子(正常结果);
  2. b.精子穿透黏液,但离开精液-黏液接触界面的距离小于500μm(约10条精子长度,结果差);
  3. c.精子穿透黏液,但很快失活或仅作摆动(异常结果);
  4. d.精子未穿透精液-黏液接触界面,指状突起形成不明显或尚未形成,但精子沿接触界面的精液侧凝集(异常结果)。

必须特别指出的是,应采用同一份宫颈黏液标本来测量精子的穿透能力,评价精子功能。

精子-宫颈黏液接触试验(SCMC)

一、试验方法

取少量(约10~50μl)排卵前宫颈黏液和大致等量的新鲜精液置于载玻片的一端,将两者充分混匀。取一滴同一精液标本,置于载玻片的另一端。精液-黏液混合物和精液滴都用盖玻片覆盖,然后放入湿润培养皿中,室温下置30min,计算摆动迅速的活动精子百分率。以单独的精液滴作为精子活力的对照,不活动、非前向缓慢活动不作活动精子计数,间歇前向的和缓慢前向运动的精子作为活动精子计数。

二、结果解释

本试验的结果在于初步评价精子或(和)宫颈黏液是否有抗精子抗体存在,因为抗精子抗体抑制精子穿透和游动高度,即高百分率的摆动精子在多数情况下存在抗精子抗体。

  1. a.阴性,摆动精子为0~25%;
  2. b.弱阳性,摆动精子为20%~50%(应重复试验,以明确抗精子抗体存在的部位);
  3. c.阳性,摆动精子为50%~75%;
  4. d.强阳性,摆动精子为75%~100%。

精子-宫颈黏液相互作用检查中的毛细管试验

一、器材

一根扁平毛细试管,长10cm,横截面为3mm2±0.3mm2,用特殊细尖记号笔在毛细管壁上每隔1cm作一标记。

二、方法

用射精后不超过1h的新鲜精液,以毛细管将宫颈黏液吸入其内,不可吸进气泡。通过弹性密封剂如硅酮胶密封的巴斯德滴管的大头制成的简单多支移液管完成毛细管的充填。在密封剂上制1个扁形小孔,以他将扁平毛细管插入其中。将扁平毛细管的开口端放入黏液池中。从管的另一端吸入足量的黏液,使半月型液面到管顶端的距离不超过2~3cm。从毛细管下端的入口处切断被牵拉的黏液,用代用黏土、模型土或类似物封闭毛细管的上口。封管时应用足量的封闭剂,以便使黏液柱稍突出于毛细管的开口。装管结束后,应在显微镜下检查毛细管黏液中是否有精子存在,如果有精子存在的话,必须检测其数量和运动情况,以便在分析新鲜精子的穿透力时进行校正。

取少许充分混合的精液(50μl)于诸如No.OO BEEM囊的贮黏液容器中,并在其盖上切一裂口以便毛细管的插入得到支撑。这样,在精子穿透过程中毛细管一直保持垂直位。如果贮液器没有盖,则应将毛细管固定,使之基本保持垂直,并用海绵或手帕覆盖贮液器开口。试验操作时的温度应保持在标准的37℃。否则,影响结果的客观性。

三、结果的评估问题

该试验主要是测定有穿透力精子沿毛细管流动的距离和密度。这一信息被综合成为单一的定量计分标准。在精子放入黏液1h后,将毛细管从贮液器中取出并用生理盐水冲洗开口端,或最好用二硫苏糖醇(DTT)或羟基乙醇冲洗,以便从黏液界面和毛细管表面去除残余精子。在40倍相差显微镜和10倍目镜的显微镜下观察。在毛细管的1cm、4cm、7cm标记处的3个视野中分别计数精子,测定3个视野中每组的精子总数,并以毛细管中任何先前进入的精子进行校正。用已知显微镜视野区中的mm2的精子数表示,这个区域的面积可用镜台测微计定,也要记录位于最前面的精子位置。试验结果用等级分表示。最高为20,这个分数等于毛细管1cm、4cm、7cm处每mm2精子分数加上先前进入的精子分数总和。按照WHO编撰的《人类精液-宫颈黏液相互作用手册》要求程序操作,即可得出客观、科学的结果。

计算方法见表

计算方法见表
计算方法见表

计算结果表

计算结果表

应该承认,这种试验要求条件较高,对于科研来说是适用的,但不适用于大规模临床的检测。

国内常用的精子毛细管穿透试验法

一、动情期母牛宫颈黏液(BCM)贮存于带塞的试管中,于4℃条件下可保存一周。

二、含人血清精子营养液配方

  1. 氯化钠:7.721g
  2. 硫酸镁:0.247g
  3. 果糖:1.0g
  4. 磷酸二氮钾:0.136g
  5. 双蒸水:加至1000ml

将代用品的pH调至7.4。存放于4℃冰箱中备用。用时取25%的血清白蛋白1ml,加6ml精子营养液混合后即可使用。

三、含牛血清白蛋白精子营养液150mg牛血清白蛋白溶于5ml精子营养液中,混合后即可使用。

四、鲜鸡蛋清 取鲜鸡蛋2枚,去蛋黄,将蛋清混合,搅拌,加100IU/ml的青霉素。

五、精浆 新鲜精液1500g/min离心15min,取上清液加青霉素100IU/ml。

  1. 以上5种代用品均分装于安瓿中,20℃保存。
  2. 穿透用毛细玻璃管,规格为内径0.91~1.1mm,长120mm。
  3. 精液池,规格为口径8mm、长40mm的平底聚苯乙烯管。

六、操作程序 试验前患者要禁欲3~5d,穿透前将排卵期的宫颈黏液或其他介质吸入毛细玻管内,顶端用胶泥封口,下端插入精液池中,池内盛0.2ml精液。垂直放入37℃水浴箱内1h观察结果,测定精子在毛细管中的穿透高度,并记录活动精子的数目。

观察指标和评分,依据世界卫生组织规定标准,即穿透高度、穿透密度和活力三项指标,采用评分的方法,对结果进行判断,试验时间可经预试验定,如30min、1h、3h。

人精子-卵细胞间相互作用评价技术的评述

精-卵细胞间相互作用的评价准确性问题,可能是目前评价人类精子受精能力的最可靠方法。因为精卵细胞相互作用异常可以导致不育,可由此而为避孕的新途径提供了重要线索。但目前对精子-透明带结合率试验结果的评价有两种不一致的见解。一种意见认为,精子与透明带结合的数量和卵细胞质量或形态结构的成熟度没有关系;而另一种意见则认为,虽然卵细胞的成熟不影响精子-透明带结合,但与精子穿透透明带的能力有关。故此,又陆续发展了一些新技术用于评价此问题,如半带分析、精子-卵黄膜结合率分析技术等。

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