免疫性不育症和不孕症的诊断

对于免疫性不育症和不孕症的诊断,需要以病史、体检、实验室检查等综合分析判断,其中AsAb的测定是诊断的关键。

诊断的间接指标

精子引起的自身或同种免疫反应包括体液免疫(产生AsAb)和细胞免疫。AsAb可作用于生精细胞而影响精子的生成,也可作用于精子而引起精子活动力下降、精子凝集、阻止精子穿透宫颈黏液及卵透明带,还可作用于受精卵引起胚胎的死亡。下列指标可作为免疫性不育和不孕症的参考指标。

一、精液常规分析

精子凝集抗体阳性患者,1/3精子计数和活动力正常,1/3精子计数减少和活动力降低,其余1/3缺乏精子。有些患者可见到精子的自发性凝集现象。

二、精子-宫颈黏液相互作用试验

体内试验:主要采用性交后试验(post-coital test,PCT)。本试验是测定宫颈黏液中的活动精子数,借以评价性交后若干小时内精子存在及功能表现,反映精子和宫颈黏液的异常情况。当有AsAb存在时,精子很快失去动力而表现为PCT异常,当然这与宫颈黏液的pH、黏液性状等也有关。

体外试验:①精子毛细管穿透试验:测定精子穿透毛细管中宫颈黏液的能力,由Kremer于1965年首先采用。以后人们又使用不同的穿透介质,如动情期母牛宫颈黏液、加白蛋白的精子营养液、鸡蛋清等代替人宫颈黏液,采用塑料管代替玻璃毛细管。AsAb存在时,影响精子穿透能力。②玻片试验:将1滴宫颈黏液滴在玻片上,盖上盖片,在盖片边缘滴精液,检查精子能否穿透进入宫颈黏液中。用1份宫颈黏液评价不同的精液标本,更能反映精子的穿透能力。③精子-宫颈黏液接触试验:由Jafer创建,取1滴排卵前期宫颈黏液放在玻片上,加1滴精液,加盖玻片使之混匀,室温置30min后观察快速颤动而不前进精子的百分率,>50%时为阳性,如夫妇间精液和宫颈黏液为阳性,则可用供精或供者宫颈黏液作交叉试验,以确定AsAb是存于精液还存在于宫颈黏液中,此类AsAb主要为IgA。

三、精子穿透去透明带仓鼠卵试验(SPA)

SPA可检测人精子受精能力,AsAb可影响精子与卵子的相互作用,因此免疫性不育者可出现SPA异常。

诊断的直接指标

AsAb检测

AsAb可存在于血清、精浆、宫颈黏液和精子表面。血清内的AsAb主要是IgG和IgM,精浆和宫颈黏液内主要是IgG和IgA,少数患者有IgE,而精子表面的AsAb主要是吸附的精浆抗体。

一、凝集反应:可检测血清和精浆内的AsAb。

直接凝集反应:①明胶凝集试验(GAT):由Kibrick于1952年报告,此法简单实用,肉眼即可观察凝集,最易检出尾对尾凝集抗体,但每次需较多量的高质量精液,而且不能观察凝集部位;②试管玻片凝集试验(TSAT):亦较常用,最易检出头对头的凝集抗体,且可观察凝集类型;③组织配型板凝集试验(TAT):试剂量小,1份精液可检测大批量样品,可以观察精子凝集部位,头对头、尾对尾凝集抗体均较敏感。此外还有玻片凝集和毛细管凝集试验,由于敏感性低,目前已较少应用。

间接凝集反应:是近几年发展较快的试验。①被动血凝试验+Coombs试验:由Mathur于1979年首先应用于AsAb检测,通过将待测精子匀浆或精浆吸附于红细胞表面,再加入兔抗人免疫球蛋白时可以出现凝集反应,可对AsAb进行定量和鉴别Ig种类的测定,但不能测定抗体结合的部位。②混合抗球蛋白反应(MAR):直接试验是用抗Rh不完全抗体致敏的人或羊红细胞与待测精液混合后,加入抗IgG或IgA血清,如果游动的精子表面结合有AsAb时,则精子与致敏的红细胞结合,形成可动的混合凝集团。③免疫珠试验(IBT):由Clark等建立,直接试验为用裹有抗人IgG、IgM、IgA的亲水性聚丙烯酰胺珠(免疫珠)来测定精子表面的AsAb。间接试验是将供精者精子与待测血清或精浆(宫颈黏液)孵育后再与免疫珠反应,如待测标本中有AsAb时就会出现可动的混合凝集团。该法特异性高,可对AsAb作定位和定抗体类型测定,近来应用较广。④免疫洗选法:由Hancock于1984年建立。先用IgG包被聚苯乙烯板,再加羊抗人IgG,然后再加新鲜供精者精子与被测血清和精浆混合液,倒置显微镜见到精子附着孔底为阳性。优点是对供精者精子活动率要求不高,但只能作定性检查,而不能定位。

二、补体依赖试验:精子抗原与AsAb相互作用,激活补体系统,损伤精子细胞膜通透性和完整性,导致精子活动力降低或丧失(可用制动试验测定)和被某些染料着色(用细胞毒试验测定)。

  1. 精子制动试验(SIT):一般采用精子制动值判定结果,近来有采用多次曝光成像法判定结果。目前认为,在诊断免疫性不育时,制动抗体比凝集更有价值。
  2. 精子细胞毒试验:较常见的方法是染色法区分死活精子。用台盼蓝染色,或伊红-苯胺黑代替台盼蓝染色。近来有用双乙酰荧光素(DAF)和溴乙锭(ethidium bromide)两种荧光素分别标记死活精子,测定精子细胞抗体较满意。

三、免疫荧光法:常用间接免疫荧光法。在精子涂片上滴加待测精子后,再加标记荧光素的抗体,然后镜检荧光强度及分布。可进行AsAb定位,敏感性高,但由于精子固定过程中内部抗原暴露,故假阳性率很高。

四、酶标记免疫法:主要有:①酶联免疫吸附测定法(ELISA),可测定血清或精浆的AsAb。先将供精者精子吸附于聚氯乙烯反应板,将待检标本与精子结合,加入酶的底物后,再测定酶的产物反应,可定量。由于反应前精子已固定,因此假阳性和假阴性较高。适用于大批量标本测定。目前已生产出AsAb检测的试剂盒,检测较为方便。②固相酶染色法(SESA),基本原理同上,但在玻片上进行,可观察精子的着色部位而进行抗体定位测定。

五、放射免疫分析(RIA):包括:①固相放射免疫结合测定法(RIBA),用整个精子或溶解的精子膜,或人工合成精子10肽作抗原,包裹在直径为3mm的聚苯乙烯珠上,抗原与待测标本(血清等)孵化,加入125I标记的金黄色葡萄球菌A蛋白,如有AsAb则A蛋白与精子-AsAb复合物中AsAb Fc段结合,测定复合物的放射性强度即可计算AsAb含量。②125I标记兔抗人球蛋白的双抗体法,其原理相似于抗球蛋白试验。A.直接法:将待测精子直接与125I标记的抗人Ig反应,测定放射性强度可直接测定精子表面的As-Ab含量。B.间接法:先将待测血清或精浆与供精混合,再与125I标记的抗人Ig结合而测定AsAb含量。此类方法灵敏度很高,可准确定量,但操作较繁琐,费用昂贵。

六、免疫印迹法(immunoblotting):采用该法测定抗精子多肽抗体。先用SDS-PAGE提取7种精子多肽,将多肽转移至醋酸纤维膜,滴加不同稀释度的待测血清,然后浸入碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG,取出后再浸入乙胺醇对硝基苯磷酸盐溶液,最后取出醋酸纤维膜,用扫描仪测定并计算蛋白含量,由此推算抗精子多肽抗体的量。此法可检出用精子凝集试验无法测出的抗精子的多肽抗体。

细胞免疫功能检测

  1. 白细胞移动抑制试验:被精子抗原致敏的淋巴细胞,在被精子抗原激活时,可释放出可溶性的淋巴因子使白细胞移动速度减慢。该法可作为测定精子抗原的细胞免疫方法,可用作免疫不育症的辅助诊断手段。
  2. 白细胞黏附抑制试验:正常人外周血液中的白细胞,在一定条件下,能黏附于清洁的玻璃表面。在精子抗原作用后,被致敏淋巴细胞的黏附能力明显下降,出现黏附抑制现象。免疫性不育症患者黏附抑制指数升高。
  3. 淋巴细胞转化试验:一般采用3 H-TdR掺入法,该法阳性率与凝集AsAb阳性率明显相关,可检测T和B细胞功能,对诊断免疫性不育症帮助较大。
  4. 外周血白细胞促凝血活性测定:其作用原理是致敏淋巴细胞再次与抗原(如精子、精浆)接触时可被激活,产生一种可溶性介质,此介质能诱导单个核细胞产生结合在细胞膜上的促凝血活性因子,从而引起血凝固加速。但该法结果与AsAb结果并不完全一致。
  5. 花环试验:采用T花环试验和活性花环试验分别测定了T细胞和活性T细胞数目,发现免疫性不育者两者均明显下降。

精浆免疫抑制活性物质的检测

  1. 抗补体法:该法检出的精浆免疫抑制物质的正常值为(430±60)u/ml。
  2. 单向免疫扩散法:该法检出的精浆免疫抑制物质的正常值为(3.0±0.3)g/L。
  3. 间接免疫荧光法:精浆免疫抑制物质位于头部者占69.7%,颈部者占21.2%尾部者9.1%。
  4. 固相酶联免疫测定法:正常人精浆免疫抑制因子DF2的平均值为(1.32±0.72)mg/ml。

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