精液的免疫学检查方法:精子凝集、AsAb检测

精液的免疫学检查主要包括精子凝集检测和AsAb的检测。

精子凝集检测

凝集在测定精子活力时进行评价,检查时可采用半定量的分级方法:从(-)(没有凝集)到(+++)(所有可动的精子凝集到一起),同时记录精子凝集的类型(头对头、尾对尾或混合型)。不活动精子之间、活动精子与黏液丝之间、活动精子与非精子细胞成分和细胞碎片等黏在一起,不能视为凝集。

正常生育男性的精子一般不发生凝集。凝集的存在提示不育可能是由免疫性因素引起,但不足以说明不育一定是免疫因素引起的。

AsAb检测

AsAb为诊断免疫性不育的最重要的指标。检测AsAb的方法有多种,包括免疫荧光法、浅盘凝集法(TAT)、乳胶珠凝集试验、精子制动试验(SIT)、固相酶染色法、免疫珠法(IBT)、混合抗球蛋白反应法(MAR)、酶联免疫吸附分析(ELISA)法、免疫金分析法等。目前我国临床上以ELISA法为主,少数单位使用WHO推荐的免疫珠试验(IBT)和混合抗球蛋白反应试验(MAR)。这三种方法可根据医院患者量的多少和能够选用的试剂盒质量而选择使用。

ELISA法

ELISA法最大的优点是可以同时检测大量标本,而且可用于抗体的分型(IgG、IgM 和IgA)。检测原理为:采用纯化的人精子膜抗原包被微孔,待测标本中的AsAb与微孔板上的精子膜抗原反应,再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,加入底物溶液,通过显色深浅来判定AsAb的存在和含量。目前,已有商品化抗精子抗体ELISA检测试剂盒。

基本操作程序:

  1. 将已包被的微孔板及所有检测试剂置于室温下平衡30min,同时配制标本稀释液(含5%小牛血清的PBS-T)。
  2. 根据不同待测标本,每孔加标本稀释液100μl或50μl,阴、阳性对照孔不加,空白对照孔加100μl标本稀释液。
  3. 依次加入标本(血清20μl,精浆和宫颈黏液50μl)和100μl阴、阳性对照。
  4. 37℃温育40min。
  5. 用PBS-T洗板4次,每次3min,拍干。
  6. 每孔加酶结合物2滴,充分混匀,用封膜覆盖,置37℃温育30min。
  7. 甩净孔内液体,加洗液,洗涤方法同上。
  8. 每孔加显色液A、B(底物溶液)各1滴,混匀后避光反应10min。
  9. 每孔加终止液1滴,终止反应。
  10. 以空白孔调零,450nm测吸光度值,P/N≥2.1为阳性,也可以直接肉眼判断(与阳性对照比较)。

IBT试验

检测原理为:采用包被羊抗人IgG、IgA的亲水性聚丙烯酰胺珠(免疫珠)来检测精子表面结合抗体、或待测血清(宫颈黏液)中的AsAb。它分为直接法和间接法。直接法检测精子表面结合抗体,具体操作步骤为:①新鲜待测精液1滴,一式3份,分别加1滴最适稀释度的羊抗人IgG、IgA、IgM包被的免疫珠悬液,混匀后加盖玻片。②置湿盒1h,然后在光学显微镜下观察。间接法检测精浆、血清或宫颈黏液中各Ig类别的AsAb。具体操作步骤为:①生育男性提供的精液(活动率>70%以上)用Baker缓冲液(葡萄糖3g,Na2HPO4•12H2O 0.6g,NaCl 0.2g,KH2PO40.01g,加水至100ml)洗2次,调精子浓度为6×107/ml。②取50μl待测血清或宫颈黏液,加50μl精子悬液,37℃温育1h,再用Baker缓冲液洗2次。③以下操作同直接法。高倍镜视野下计数附着2个或更多免疫珠的活动精子百分率,至少计数200条精子。

MAR试验

反应原理和操作步骤类似IBT试验。只不过用人IgG或IgA包被于O型人红细胞、绵羊红细胞或乳胶颗粒上,再向悬浮液中加入特异性的抗人IgG或抗人IgA,其起“桥连”的作用。结果判断亦类似于IBT试验。

正常生育男性精子表面、精浆及血清中AsAb均应为阴性。ELISA法以阴性报告,IBT和MAR法以结合免疫珠或颗粒的活动精子小于50%为正常。

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