血清及精浆抗精子抗体检查

男性及女性患者血中和体液中的抗精子抗体是精子、精浆通过自身免疫或同种免疫而产生的。正常情况下,由于解剖学原因,精子是与血液循环系统隔绝的,从来没有与淋巴细胞相遇,所以不会发生免疫反应。一旦由于生殖道损伤或炎症,使它们相遇,则会发生免疫反应,产生抗精子抗体(antisperm antibody,AsAb)。临床上检测AsAb的方法主要有:精子凝集实验、酶联免疫吸附分析(ELISA)、精子制动实验、免疫珠实验、混合抗球蛋白反应实验等,以ELISA法应用最为广泛。检测标本类型为不育夫妇的血清或生殖道分泌物(宫颈黏液、精液)。

精子凝集实验

明胶凝集实验

一、明胶凝集实验(gelatin agglutination test,GAT)准备

  1. 配制Baker液(Baker solution):葡萄糖3.00g,Na2HPO4•7H2O 0.46g;NaCl 0.20g;KH2PO4 0.01g;加双蒸水至100ml。
  2. 用Baker液配制10%白明胶溶液,并置37℃水浴中备用。
  3. 精子悬浮液:取正常新鲜精液(精子密度为80×106/ml左右,活动率>60%,a、b两级活动精子>70%),室温液化,用Baker液稀释至40×106/ ml,置37℃水浴中保存备用。
  4. 待检血清及对照血清处理,均经56℃水浴加热30分钟,以灭活补体。随后用Baker液,将两种血清均作1∶4~1∶32倍数稀释,存放于37℃水浴中备用。

二、操作

  1. 取一定量的精子悬浮液,加入等量的10%明胶溶液,充分混合后,取0.3ml分别加入装有0.3ml对倍稀释血清的各支小试管内,并使其充分混合。
  2. 将混合液分别用毛细吸管移置另一小试管(3mm×30mm)内,37℃孵育2小时,移置4℃放置5分钟,待明胶凝固后,观察明胶内精子凝集情况,并判断结果。

三、结果判读

  1. 阴性:精子在明胶内均匀分散,若以黑纸作背面对光观察,呈均匀乳白色,不见凝集块。
  2. 阳性:精子成小凝集块,对光观察可见小凝集块有如雪花纷飞状,不难鉴别。
  3. 抗体效价:以阳性反应的最高血清稀释倍数为血清凝集抗体效价。

试管玻片凝集实验

一、试管玻片凝集实验(F-D法)准备

  1. 配制Baker液(同上)或生理盐水。
  2. 从患者血液中分离血清,经56℃30分钟灭活补体处理,并以Baker液或生理盐水把原血清作1∶5稀释。
  3. 精子悬浮液:取新鲜正常精液(同上)以Baker液或生理盐水调整精子数为4×106/ml。

二、操作

  1. 取0.25ml处理后待检血清移置一小试管,加入0.25ml精子悬浮液。在另一小试管内加0.25ml Baker液或生理盐水,再加入0.25ml精子悬浮液作阴性对照。
  2. 在37℃条件下孵育30分钟、60分钟、120分钟、240分钟,从小试管内分别取出1滴混合液放在载玻片上,加上盖玻片。
  3. 在高倍镜下(400×),观察精子凝集情况。

三、结果判读

  1. 阴性:未见精子凝集。
  2. 阳性:在10个高倍视野下,有5个以上视野出现2个以上精子凝集者,判为阳性。

毛细管凝集实验

一、毛细管凝集实验(sperm agglutination testin capillary tube)准备

  1. 配制Baker液。
  2. 制作精子悬浮液:把新鲜、正常、液化后的精液用Baker液调整精子浓度为40×106/ml。
  3. 用Baker液将灭活处理后的待检血清作对倍稀释。
  4. 毛细管内径1~2mm,长度75~100mm,经清洁灭菌处理。

二、操作

  1. 取一定量精子悬浮液与等量对倍稀释后待检血清混合。
  2. 把混合液灌注入备用的毛细管内,两端用橡皮泥密封,直立于室温(20~25℃)温育1~2小时后观察结果。

三、结果判读

  1. 阴性:毛细管内呈均匀乳浊色。
  2. 阳性:可见毛细管内有小凝集块。
  3. 抗体效价:以阳性终点的血清稀释倍数为凝集效价。

注:凝集精子,若采用经Baker液洗净的精子作悬浮液后效价可能提高。

浅盘凝集实验

一、浅盘凝集实验(tray agglutination test,TAT)准备

  1. 配制Baker液。
  2. 用Baker液配10%BSA。
  3. 洁净浅盘(或微量反应板)。
  4. 精子悬浮液:将精液分装于2~3支小试管内,其面叠加10%BSA 0.5ml,放置37℃1小时,收集上层精子,用Baker液调整精子浓度为40× 106/ml。
  5. 将待检及对照血清做灭活补体处理(56℃ 30分钟),然后把血清进行1∶4~1∶32对倍稀释。

二、操作

  1. 浅盘孔上加液状石蜡覆盖,分别以微量加样器把5µl血清及1µl精子悬液注入浅盘孔的底部,并用小型振荡器使其充分混合。
  2. 放37℃1小时或室温(25℃)4小时温育。
  3. 用倒置显微镜,观察结果。低倍镜(40×,100×)看凝集总体情况,高倍镜(200×,400×)观察凝集型。

三、结果判读

  1. 阳性:1∶8以上血清稀释度有明显的精子凝集块。
  2. 阴性:精子呈分散自由活动,无凝集块。
  3. 凝集强度:精子全部或≥75%凝集记+++;精子有≥50%而≤75%凝集,且有较大的凝集块记++;精子有≤50%凝集,凝集块小而分散记+。

精子制动化实验

1968年Isojima等人建立了依赖补体的精子制动化因子的检测方法,最初建立的是精子制动化半定量测定法,其后发展为定量测定法、微量测定法。1990年辰已贤一等提出了简化的精子制动实验(sperm immobilization,SIT)。

一、实验准备

  1. 精子悬浮液:取正常新鲜精液,置室温液化20分钟,加入3~4倍量10%灭活兔血清生理盐水,充分混合后以1000r/min,5分钟离心,去上清,沉渣以10%兔血清生理盐水溶液10ml造成混悬液,如此洗涤2次,尽量除去精浆,第2次洗涤后的精子沉淀,用10%兔血清生理盐水溶液调整精子浓度为40×106/ml,或者就在沉渣上面轻轻加入适量的10%兔血清生理盐水,静置室温,让活动精子上游,收集上层精子,调整浓度为40×106/ml备用。
  2. 阴性对照血清:取未婚妇女血清,经56℃30分钟灭活处理后,预作精子制动化检测,证明无精子制动作用,以0.5ml量分装于小试管内,置-20℃中冻结保存,临用前取出1支溶解备用。
  3. 补体血清:采用市售或自己制备的豚鼠血清。

二、操作

  1. A小试管(实验管):加入灭活待检血清0.25ml,精子悬浮液0.025ml,补体0.05ml,充分混合后,置32℃孵育60分钟。
  2. B小试管(对照管):加入对照血清0.25ml,精子悬浮液0.025ml,补体0.05ml,混合后作同上处理。
  3. C小管(患者血清对照管):目的是观察患者血清有无使精子出现非特异性制动作用。因此在C管中加入患者血清0.25ml,精子悬浮液0.025ml,但不加补体,混合后作同上处理。
  4. 精子不动化值计算:孵育之后,分别从A、B、C管各取1滴混悬液放在载玻片上,用显微镜(200~400×)观察活动精子数,具体可观察4个视野,每个视野数50个精子,总数中求出运动精子的百分率,即精子的运动率(%)。

三、结果判读

  1. A管的精子运动率为T%;B管的精子运动率为C%;精子不动化值(sperm immobilization value,SIV)为SIV=B管C%/A管T%=C/T≥2为阳性。
  2. C管只作为实验是否成立的判断,若C管出现制动作用,说明检体血清有非特异性制动作用,故实验不成立。

酶联免疫吸附实验

一、原理:酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)用带正电荷的聚氯乙烯(PVC)微量反应板,将精子抗原吸附到聚氯乙烯固相载体表面,其固相抗原可与待测标本中抗精子抗体(As-Ab)结合,并与加入的抗人IgG酶结合物起反应,形成抗原抗体酶结合物,最终在酶底物作用下而显色。

二、试剂:包被液:0.01mol/L pH 9.6碳酸钠缓冲液:Na2CO3 1.06g;NaHCO3 0.84g;加双蒸水至1000ml。缓冲液:0.01mol/L pH 7.4 PBS:

三、操作:

  1. 精子抗原制备:筛选收集精液常规检查正常的精液,用生理盐水反复离心洗涤,尽可能除去精浆,经超声波超声粉碎,10~15分钟高速离心,吸上清,测定上清液蛋白浓度,将蛋白浓度稀释为3.5~5.0µg/ml,为精子抗原溶液。
  2. 反应板包被抗原:将人精子抗原稀释成3.5~5µg/ml,包被液加到聚氯乙烯微量测定板内,每孔100µl,置4℃冰箱过夜。
  3. 封闭处理:次日早晨,倾去抗原溶液,用洗涤PBS洗3次,每次5分钟,每次洗涤后都要将板在纸上拍干,再加入1%的聚乙烯醇溶液200%µl封闭,置室温1小时后同上法洗涤。
  4. 加待测样品:样品用PBS稀释100倍,每孔加入100µl,同时加As-Ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照,置37℃温育1小时,同上法洗涤。
  5. 加酶结合物:HRP-Protein A以1∶640稀释,每孔加入100µl,置室温1小时,同上洗涤。
  6. 酶反应:加新鲜配制的OPD底物溶液,每孔加入50µl,置室温暗处10分钟,再加10%H2SO4终止液每孔50µl。

三、结果判读:用酶标测定仪490µm测其OD值,OD值≥2.0时为阳性。

混合抗球蛋白反应实验

一、原理:混合抗球蛋白反应实验(mixed antiglobulin reaction test,MAR test)由Coombs及Rumke于1973年首先报道,原理为经典的Coombs实验。由于在本实验中阳性表现为活动精子与敏化乳胶(或红细胞)的混合凝集,故又称为混合凝集实验。先制备吸附有人IgG的乳胶颗粒或绵羊红细胞,然后将精液与包被的乳胶颗粒一起作用,再与抗人IgG抗血清反应。如果精子包被有As-Ab,可形成活动的精子与乳胶颗粒的混合凝集物。反之,乳胶颗粒则互相黏着成团。

二、试剂:①人IgG包被的乳胶颗粒或绵羊红细胞。②抗人IgG抗血清。

三、操作:

直接法:检测活动精子表面的精子结合抗体。

  1. 取新鲜液化待检精液10µl于载玻片上。
  2. 加10µl乳胶抗原并用盖玻片充分混匀。
  3. 加10µl抗血清,再用盖玻片充分混匀,盖上盖玻片,5分钟内镜下(400×)看结果。

间接法:检测血清、生殖道分泌液中的精子抗体。

  1. 待检血清或生殖道分泌液经56℃30分钟灭活。
  2. 待检血清或生殖道分泌液5µl加培养液35µl于小试管中。
  3. 加新鲜液化正常人精液40µl混匀,37℃1小时。
  4. 取上述保温后混合物10µl于载玻片上。
  5. 以下按直接法2、3步骤操作。

四、结果判读:没有包被抗体的精子可以在乳胶颗粒之间自由泳动,而乳胶颗粒自己黏附成团。如果精子上包被有抗精子抗体,活动精子黏着乳胶颗粒,开始时可以看到这些活动精子周围黏着几个或一串乳胶颗粒来回游动,最后凝聚块变得越来越大,黏附到一起的精子只能在原地摆动。计数黏着有乳胶颗粒的活动精子的百分率(%)。当40%或更多运动精子黏附有这种颗粒时,诊断为免疫性不育。10%~40%运动精子被黏附时,为可疑免疫性不育。

免疫珠实验

一、原理:免疫珠(immunobead)是以共价键结合了兔抗人免疫球蛋白抗体的聚丙烯酰胺珠。由活动精子与交联珠间的连接判断精子表面存在有精子抗体及相应的免疫球蛋白类型。当精子在免疫珠悬液中游动时,那些表面有抗体的精子黏附到免疫珠上。因此,可以测定表面包有抗体的精子比例。间接免疫珠实验(immunobead test,IBT)是现时公认检测体液标本抗精子抗体最为敏感而特异的方法。

二、实验准备:

  1. 正常供者精子,采自新鲜射出精液,精子上应无抗精子抗体包被,存活率为70%以上,活动度a、b级精子应为70%以上;
  2. 免疫珠:羊抗人IgG、IgA;
  3. 缓冲液:Tyrode溶液(g/L),市场有售;
  4. BSA溶液:0.4%(以Tyrode溶液配制)。

三、操作:

直接法:检测去精浆精子表面附着的免疫球蛋白。

  1. 2个离心管中分别加入抗IgG和抗IgA免疫珠0.2ml,用0.4%BSA缓冲液稀释至10ml;
  2. 在另1支离心管中加入0.2ml精液,并且用0.4%BSA溶液稀释成1ml;
  3. 将3支离心管离心500×g 5分钟,弃去上清,将免疫珠重悬在10ml 0.4% BSA溶液中;
  4. 如步骤3再次洗涤精液后,将沉淀的精子重悬于0.2m10.4%BSA溶液。
  5. 在载玻片的两端分别加5µl IgG和IgA免疫珠;
  6. 再加5µl精液悬液到免疫珠上,用盖玻片边缘充分混匀,分别在两滴混合液上盖上一张盖玻片。
  7. 湿盒静置15分钟。
  8. 用400×的相差或普通光学显微镜观察,分别记录含有抗IgG和IgA免疫珠的混合物中黏有免疫珠的活动精子百分率。

间接法:检查血清或精浆中抗精子抗体。

  1. 将正常供者精子用0.4%BSA溶液如直接法中所述洗涤2次,同时如直接法准备免疫珠悬液。
  2. 将上述洗涤过的精子,用Tyrode溶液调整精子浓度至50×106/ml。
  3. 将50µl经过洗涤的精子加到50µl待检血清或精浆中,于37℃孵育1小时。
  4. 如直接法步骤,将精子洗2次,再如直接法5)至8)步骤进行测定。
  5. 结果判读 两种方法的结果判定均为:≥10%活动精子粘有免疫珠,结果为(+)。

注意:温度对精子活动影响很大,实验过程应保持室温在22℃左右。

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