精子功能指标测定

精子尾部低渗膨胀实验

原理:精子尾部低渗膨胀实验(hypoosmotic swelling test,HOST)是精子细胞在低渗环境下,正常细胞膜对低渗条件产生细胞形态变异的检查,即通过检测精子尾部的肿胀率来评价精子膜的完整性。

试剂配制:枸橼酸钠(Na3C6H5O7•2H2O)0.735g;果糖1.351g;溶于100ml蒸馏水中。分装冷冻,于-20℃存放,用前解冻并充分混匀。

操作:

  1. 取1ml低渗膨胀溶液于一加盖的Eppendorf试管中,37℃温浴5分钟。
  2. 加入0.1ml液化精液,混匀,37℃温浴30分钟,在相差显微镜下观察精子尾部形状的变化。

结果判读:计算200个精子中膨胀精子数的百分比。精子尾部肿胀率≥60%为HOS实验正常。

精子-宫颈黏液相互作用

一、体内实验(性交后实验)

方法:分别将阴道后穹隆部吸取的混合标本、宫颈腔中吸取的黏液标本迅速地置于载玻片上,盖上盖玻片,于光学显微镜下检查。

结果判读:正常妇女在周期中期与精液指标正常的男子性交后9~12小时内,宫颈黏液在每高倍视野通常有50个以上的活动精子,其活力属于a,b两级。每高倍视野中有20或更多的a级前向运动的精子即可认为结果良好。如每高倍视野中活动良好精子数不足10个,则表示精子穿透能力减弱或宫颈黏液异常。

二、体外实验

包括玻片法和毛细管穿透实验。

玻片法:

  1. 操作:①将1滴宫颈黏液置于载玻片上,用盖玻片(22mm×22mm)铺平。玻片之间的标准厚度用硅化的100μm玻璃微球来控制。载玻片两侧各滴1滴精液。使与盖玻片边缘接触,借毛细作用精液移向盖玻片下,这样就在宫颈黏液和精液之间出现一清晰的接触界面。②将玻片置于湿润的温箱中,37℃温育30分钟。
  2. 结果判读:①精子穿透黏液:并有90%以上具有明显直线运动的活精子(正常结果)。②精子穿透黏液:但离开精液-黏液接触界面的距离小于500μm(约10条精子长度,结果差)。③精子穿透黏液:但很快失活或仅作摆动(异常结果);④精子未穿透精液-黏液接触界面,指状突起形成不明显或尚未形成,但精子沿接触界面的精液侧凝集(异常结果)。

毛细管穿透实验:

  1. 操作:①准备长6cm,直径3mm,横截面为0.33mm厚的毛细管;②在毛细管上作好1cm,4.5cm,5.0cm记号;③将宫颈黏液吸入毛细管5cm刻度线,不可吸进气泡。用封口胶将靠近5cm处的毛细管口封住,垂直放置备用;④取0.5ml充分混合的精液置于小试管中,将装好宫颈黏液并封口的毛细管未封口一端置入小试管的精液液面5mm处,于固定装置上固定,37℃保温,开始记时。⑤2小时、24小时在显微镜下,用低倍视野计数每1cm、4.5cm距离点的精子数目,观察5个视野求平均数。
  2. 观察指标及评估方法:依据世界卫生组织规定标准,即穿透高度,穿透密度和活力三项指标,采用评分的方法,对结果进行判断。

三、精子-宫颈黏液接触实验(sperm cervical muc us contact test,SCMC)

操作:

  1. 取少量排卵前宫颈黏液和等量的新鲜精液置于载玻片的一端,将二者充分混匀。
  2. 取1滴新鲜精液置于载玻片另一端。
  3. 分别盖玻片覆盖,放入湿润的培养皿中,放置30分钟。
  4. 计数摆动迅速的活动精子百分率。以精子滴的精子活力为对照,不活动、非前向缓慢活动不作为活动精子计数,而间歇前向、缓慢前向运动的精子作为活动精子计数。

结果判读:

  1.  阴性:摆动精子为0~25%。
  2. 弱阳性:摆动精子为20%~50%。
  3. 阳性:摆动精子为50%~75%。
  4. 强阳性:摆动精子为70%~100%。

精子-去透明带仓鼠卵穿透实验

一、原理

精子-去透明带仓鼠卵穿透实验(sperm penetration of zona-free hamster egg assay,SPA)的原理是用酶除去仓鼠卵的透明带,使人精子能够与去透明带仓鼠卵受精,形成雄性原核,即用仓鼠卵代替人卵,分析人精子穿入去透明带仓鼠卵的百分率,评价其受精能力。

二、方法

  1. 金黄地鼠超排卵后用透明质酸酶及胰酶消化去除颗粒细胞及透明带。
  2. 精子获能培养后,与去透明带金黄地鼠卵孵育2~3小时后观察结果。

三、观察指标

  1. 受精率(fertilization rate):受精卵子数/卵子总数×100%,一般认为正常标准≥10%。
  2. 受精指数(fertilization index):穿入卵子的精子总数/卵子总数,一般认为受精指数≥5,也可根据实验条件及人群特征进行统计分析后做出相应调整。

精子顶体反应实验及顶体酶活性测定

在自然情况下如没有顶体反应的发生,受精是无法进行的。男性的精子顶体反应的检查是了解其生育能力的一个重要方面。精子顶体反应实验(acrosome reaction test)方法有凝血素免疫荧光染色法法、考马斯蓝染色等。顶体酶活性检测通常用生化法。

一、凝血素免疫荧光染色法

原理:顶体内含有大量的糖蛋白,能与植物凝集素如豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin,PSA)等特异结合,用带有荧光素的豌豆凝集素标记精子,可显示顶体内容物。精子发生反应后,顶体内容物丢失,则顶体内无荧光。

操作:①手淫法取得精液,室温放置使其液化,精液加入2~3倍的BWW培养液在试管内混匀,倾斜45°放置在37℃ 5%CO2培养箱中让精子上游30~60分钟。②取上层培养液,在425g下离心10分钟,弃上清,留试管底部的白色细砂粒样沉淀,用含有0.35%BSA(或HAS)的BWW培养液悬浮起精子(用培养液调整精子密度大约在1×106个/m1,再放置在37℃5% CO2培养箱中孵育5~8小时使精子获能。③在含有精子的培养液中加入诱导精子顶体反应的钙离子载体A23187(培养液中A23187的浓度为10µmol/L),37℃培养箱中再放置1小时,精子顶体反应会发生。④取出后立即离心,在425g下离心10分钟,弃上清,沉淀用:PBS悬浮后涂片,待晾干后,用甲醇固定,再用豌豆凝集素PSA(浓度为100mg/L,用0.1mmol、pH 7.4的PBS溶液配制)染色30分钟,最后用荧光显微镜观察结果。

结果判读:①顶体完整的活精子不着色;②顶体帽无荧光或仅核有荧光者为发生反应的精子;③整个精子有荧光为死精子。

二、考马斯蓝染色法

  1. 原理:精子顶体内含有大量的酶等蛋白质,易被考马斯蓝着色,顶体反应后内容物丢失,则顶体区不着色或者色浅。
  2. 结果判读:顶体完整精子的顶体区染成紫蓝色;不着色或染成淡紫色为发生顶体反应的精子。

三、顶体酶活性检测

  1. 试剂:①乙醇脱氢酶(ADH);②苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE);③氧化型辅酶Ⅰ(NAD);④Tris-Hcl缓冲液(pH 8.5,0.05mol/L);⑤用新配制的Tris-Hcl缓冲液配制:NAD溶液(20mg/ml),BAEE溶液(1mg/ml),ADH溶液(3.46mg/ml)。
  2. 测定原理:①BAEE+H2O→苯甲酰精氨酸+乙醇(顶体酶);②乙醇+NAD+→乙醛+ NADH+H+(ADH)。随着NAD+被还原成NADH,反应液在pH 8.5,25℃条件下366nm的吸光度不断升高。
  3. 操作:①预处理:取0.25ml液化精液800g离心10分钟,弃精浆,用0.15mol/L的NaCl溶液1ml洗涤精子,于盐酸溶液中充分混匀,离心5分钟,弃上清,加入2%醋酸水溶液0.25ml,盖上盖子,于4℃冰箱中抽提液16~24小时,1200g离心10分钟,留上清待用;②于比色皿中依次加入0.1ml NAD溶液,0.5ml的BAEE溶液,0.1ml的 ADH溶液,2.25ml的Tris-Hcl缓冲液,充分混匀;③25℃条件下预温5分钟;④加0.05ml的顶体酶醋酸抽提液,充分混匀;⑤记下加入酶液后10分钟反应液在366nm下吸光度的变化值。
  4. 结果判读:①1mU的顶体酶活力为在上述条件下(pH 8.5,25℃),每分钟水解1nmol 的BAEE所需的顶体酶量。②酶活性(mU/ml)= ΔA/0.01×20(ΔA为反应时间内的吸光度变化值)。

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