精浆果糖的检测

精浆果糖的测定几乎被在世界上所有男科实验室进行,而且,WHO也推荐以精浆果糖浓度的测定作为评价精囊功能的指标。目前,用于检测精浆果糖的方法有间苯二酚显色法、气相层析法、吲哚显色法等多种方法。尤以间苯二酚法为临床男科实验室常用,该法操作简单,无需特殊仪器,特异性好。

一、检测原理

目前临床上精浆果糖检测基本以间苯二酚法为主。原理为:果糖与溶于强酸的间苯二酚溶液加热后,产生红色化合物,参比标准品,即可知其含量。

二、所用试剂

  1. 果糖标准贮存液(500mg/L):50mg果糖加蒸馏水至100ml。
  2. 果糖标准液(50mg/L):取果糖标准贮存液1ml,加蒸馏水至10ml。
  3. 0.175mol/L ZnSO4•7H2O:称取50.2g加蒸馏水至1L。
  4. 0.15mol/L Ba(OH)2•8H2O:称取47.3g加蒸馏水至1L。
  5. 1g/L间苯二酚:用95%乙醇配制。
  6. 10mol/L HCl:于87ml蒸馏水中加入浓HCl 413ml。

三、操作步骤

基本操作步骤为:①精浆预处理:取精浆0.1ml,加蒸馏水2.9ml,混匀;加Ba(OH)2 (0.15mol/L)0.5ml,ZnSO4(0.175mol/L)0.5ml,混匀;静置5min,离心取上清液备用。②按下表加入试剂。加完后,90℃水浴10min,流水冷却,490nm波长下以空白管调零读取吸光度值。③结果计算:果糖(g/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×2。

间苯二酚法测定精浆果糖操作步骤

间苯二酚法测定精浆果糖操作步骤

四、正常参考值

正常生育男性精浆果糖参考值为0.87~3.95g/L。WHO推荐的正常参考值为每次射精精液≥13μmol。

五、方法学评价

间苯二酚法检测精浆果糖在临床上已使用十多年,该法重复性和准确性在所有精浆生化检测指标中位于前列,这依赖于显色的相对稳定,但试验过程中必须严格遵守操作程序,加样必须准确,去蛋白的过程中,加入氢氧化钡和硫酸锌后均需充分混匀,而且吸取上清液时不要混入沉淀。由于浓盐酸具有挥发性,应在通风橱中进行操作,且反应的温度和时间必须准确。只要严格按操作程序进行,该法检测精浆果糖在临床上是可行的,但要向全自动检测方向发展,浓盐酸的使用和90℃的高温将是瓶颈,更换新的检测方法可能势在必行。

为了保证精浆果糖检测结果的准确可靠,精浆果糖检测中需注意四点:①果糖标准液配制后应放置2周后使用,而使用2周后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液。果糖为多羟基酮糖,有不对称碳原子,具有旋光性,在水溶液中有变旋现象,经过大约2周的时间,可能存在的5种异构体达到平衡,此旋光度也达到一个平衡值而相对稳定,因而在随后的2周时间内吸光度值相对稳定且变异小。由于水为弱亲核试剂,经过一段时间酮糖转变为醛糖并达到一个平衡。由于间苯二酚与浓盐酸遇酮糖呈红色,遇醛糖呈很浅的颜色,一旦果糖在水溶液中逐渐转变为醛糖,吸光度值将逐渐降低,此时需更换新的果糖标准液。一般来讲,不同批次检测时,果糖标准液的吸光度应相对恒定。②离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异。离心速度增加时精浆果糖浓度有升高趋势。可能原因为:离心速度高时,精浆中残余精子浓度明显降低,由于精子不含果糖,因而低速离心时精浆中残留的精子将占据一定体积,使实际精浆量有所降低,因而浓度有降低趋势。因此,为了得到最真实的精浆果糖浓度值,离心速度不得低于3000g离心15min。③精液液化后应立即离心将精子和精浆分离,否则会影响精浆果糖检测结果。这是由于体外活动精子不断消耗果糖。随着精液放置时间的延长,精浆果糖浓度逐渐降低。精液放置2h后离心所得精浆果糖浓度比立即离心时精浆果糖浓度显著降低,放置4h比2h又显著降低,而且,此种降低与活动精子浓度呈显著正相关。④精浆果糖测定中应引入质量控制体系。对每批标本的测试都应该带有高、低浓度的两种质控品,可以用混合的冻融精浆标本作为质控品。

六、临床意义

精浆果糖浓度的测定可用于评价精囊分泌功能。精浆果糖可为精子的运动提供能量。当精囊功能紊乱时,精液总量减少,精浆果糖含量降低,进而引起精子活力不足,导致不育。

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