附睾及男性附属性腺功能指标测定

附睾功能指标

附睾是精子运送、成熟、贮存的场所,并对精子起保护作用,附睾功能紊乱直接影响男性的生育力。左旋肉毒碱和中性α-葡糖苷酶是临床常使用的附睾标志物。中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱的特异性、敏感性更高。

精浆中性α-葡糖苷酶测定

1. 原理:麦芽糖两个吡喃葡萄糖残基,由α-1,4-糖苷键相连,经α-葡糖苷酶作用,水解糖苷键生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法测定其生成量。

2. 试剂:①醋酸盐缓冲液;②麦芽糖基质液;③葡萄糖标准液;④Tris -HCl缓冲液;⑤9.0g/L NaCl溶液;⑥葡萄糖氧化酶试剂。

3. 操作步骤

(1) 临用前配制葡萄糖氧化酶试剂。

(2) 将液化的精液离心沉淀后,取精浆,按下表操作测定。

混匀,37℃水浴15分钟后用505nm波长,以空白管调零,读取各管的吸光度

(3) 计算:α-糖苷酶浓度(U/ml)=测定管吸光度/标准管吸光度×20。单位定义:每毫升精浆与底物在37℃作用30分钟,产生0.1mg葡萄糖为1单位。

(4) 参考值:35.1~87.8U/ml。

(5) 注意事项:精液在操作中应注意以下几个问题:

1) 取液化好的精液标本,3000rpm离心10分钟,取上清精浆1~2ml,放置于-20℃保存备用;

2) 离心好的精浆保存所用器皿必须经硫酸或盐酸浸泡过夜,然后洗净备用。若用一次性聚乙烯试管效果更佳;

3) 尽快分离精浆,及时测定。

精浆肉毒碱测定

1. 原理:肉毒碱与乙酰辅酶A通过肉毒碱酰基转移酶作用,催化生成乙酰肉毒碱和辅酶A,辅酶A和埃尔曼试剂DTNB,发生反应生成黄色的终产物,其吸收光谱为412nm。

2. 试剂:①0.1mol/L,pH 7.5,Tris-HCl缓冲液;②氯仿-异丁醇混合液,按氯仿:异丁醇=2∶1配制;③DTNB溶液:用Tris-HCl缓冲液进行配制,使成2mmol/ml浓度;④乙酰辅酶A溶液:用Tris-HCl缓冲液进行配制,使成8mmol/ml浓度,临用前新鲜配制;⑤CAT(肉毒碱酰基转移酶)溶液:用Tris-HCl缓冲液将酶原液稀释30倍,临用前新鲜配制;⑥肉毒碱标准液:取L-肉毒碱一定用量,Tris-HCl缓冲液进行配制,配成8mmol/ml浓度,临用前稀释80倍成0.1mmol/ml浓度的应用液。

3. 操作步骤

(1) 取精浆0.15ml加95%乙醇0.15ml混匀,室温放置2小时后,3000r/min离心20分钟,取上清液在40℃下减压蒸发至干燥。

(2) 干燥物溶于3ml蒸馏水中,加4ml氯仿-异丁醇混合液,混匀,5分钟后,3000r/min离心20分钟,取上层水液2ml于试管中,在40℃下减压蒸发至干燥,备用。

(3) B-空白管、U-样品管、S-标准管

混匀,置水浴37℃,30分钟后,于412nm波长读取吸光度。根据标准曲线求出精浆肉毒碱含量。

(4) 标准曲线的绘制:以肉毒碱含量100、200、400、600、800mmol/ml为标准点和所测吸光度回归绘制标准曲线。

4. 参考值

461.5±191.63mmol/ml。

前列腺功能指标

精浆中的锌、枸橼酸和酸性磷酸酶的含量是前列腺分泌功能可信的检测方法,这些标志物之间存在很好的相关性。

精浆酸性磷酸酶检测

1. 实验原理(P-硝基酚磷酸法,WHO推荐方法):酸性磷酸酶在酸性条件下分解P-硝基酚磷酸=钠产生色原性物质P-硝基酚(PNP),通过测定PNP浓度来确定酶活力的高低。

2. 试剂:①枸橼酸缓冲液(0.09mol/L,pH 4.8);②6mol/L氢氧化钠溶液;③P-硝基酚磷酸(底物)溶液;④50mmol/L P-硝基酚(PNP);⑤12g/L硫酸氢钠(NaHSO4•H2O)。

3. 操作步骤

(1) 预处理:①液化后,以3000r离心10分钟,分离,将精浆20μl与硫酸氢钠20μl混合;②将精浆稀释1000倍待测。

(2) 操作程序:

在405nm波长,读取光密度。

(3) 标准曲线制备:将试剂盒内提供的标准品按照说明书要求加入相对应的试管,加完试剂后,立即充分混匀,用405nm波长、0号管调零,读取吸光度值,所得读数与其相应的酸性磷酸酶单位(依次为100、200、300、400、500U)回归绘制标准曲线。

4. 计算:1单位酸性磷酸酶=37℃下每分钟产生1μmol PNP,精浆中酸性磷酸酶活性=(测定管吸光度-空白管吸光度)/标准曲线斜率× 37U/ml,总活性=U/ml×1次射精的精液体积(ml)= U/1次射精。

5. 参考值:≥200u/1次射精。

精浆枸橼酸检测

1. 实验原理:精浆去蛋白后,精浆枸橼酸可与吡啶、醋酸形成胭脂红色化合物,其显色与枸橼酸含量成正比。

2. 试剂:①TBA缓冲液(pH 7.7)的配制:14.9g三乙醇胺溶于750ml蒸馏水,加浓盐酸调pH至7.6;0.027g ZnCl2必须完全溶解;加ZnCl2溶液于三乙醇胺;加0.5g叠氮钠;②15%三氯醋酸(TCA);③6mol/L NaOH;④NADH(还原性辅酶Ⅰ);⑤枸橼酸裂解酶。

3. 操作步骤:①制备精浆:精液以3000r/min离心15分钟取精浆待用;②预处理:0.1ml精浆于4.95ml TCA中,加0.75ml氢氧化钠溶液(6ml/l),pH>7.0,必要时可调为碱性,提取液必须清亮;③将0.5ml NADH溶液,2.3ml TBA缓冲液,0.2ml精浆提取液加在一个比色杯中,混合;④于340nm波长测吸光度A1;⑤加20μl枸橼酸裂解酶溶液,混合,并放置5分钟;⑥测吸光度A2。

4. 结果计算:枸橼酸浓度(mmol/L)=(A1-A2)/消光系数×提取稀释度×吸光度稀释度= (A1-A2)/6.3×58×(3.02ml/0.2ml)=(A1-A2)/139。

5. 参考值:≥52μmol/1次射精。

精囊腺功能指标

果糖由精囊分泌,可用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症和输精管、精囊发育不良引起的无精症。

精液果糖测定(间苯二酚法)

1. 原理:利用Seliwanoff反应原理,间苯二酚与盐酸遇果糖产生红色化合物,在490nm与标准比色,求其含量试剂。

2. 试剂:①0.175mol/L ZnSO4;②0.15mol/L Ba(OH)2•8H2O;③1g/L间苯二酚(雷锁辛)用95%乙醇配制;④10mol/L HCl;于87ml蒸馏水中加入HCl 413ml;⑤果糖标准液(50mg/L)。

3. 操作步骤

(1) 取精浆50ml,加蒸馏水1450ml,混匀,加0.15mol/L Ba(OH)2 250μl、0.175mol/L ZnSO4 250μl混匀,静置5分钟,3000rpm离心取上清备用。

(2) 间苯二酚法测定精浆果糖操作步骤。

90℃水冷10分钟,流水冷却,490nm,空白管调零,读取吸光度

(3) 计算:果糖(g/L)=(测定吸光度/标准管吸光度)×2

4. 参考值:0.87~3.95g/L。

精液果糖测定(吲哚法)

1. 原理:果糖与吲哚在强酸、加热环境中生成黄色化合物,该有色物质在470nm波长有最大吸收峰,其吸光度大小与果糖含量成正比。

2. 试剂:①1.8% ZnSO4•7H2O;②0.1mol NaOH;③吲哚试剂:溶200mg苯甲酸于100ml蒸馏水中,在热水浴(约60℃)中反复振荡,使之溶解,但所有苯甲酸都溶解后,再加入25mg吲哚,将此溶液过滤后4℃贮存;④果糖标准贮存液(2.8mmol/L):溶50.4mg果糖于100ml蒸馏水中,冰冷储存;⑤果糖标准应用液:分析当天,将标准储存液分别稀释成0.28nmol/L和0.14nmol/L两种浓度。

3. 操作步骤

(1) 预处理:取0.1ml精浆加4.9ml蒸馏水1∶50稀释,取1ml稀释的精浆加0.3ml 1.8% ZnSO4,混匀,再加0.2ml NaOH,充分混合后放置15分钟,2000r离心20分钟,取0.5ml上清液进行分析。

(2) 吲哚法测定精浆果糖操作程序。

试管加塞后50℃孵育20分钟,冷水冷却至室温,470nm读取吸光度

(3) 计算:精浆果糖浓度(mmol/L)=(AS× 1/2×1.14/S+0.28/S2)×75

4. 参考值:≥13μmol/1次射精。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/5468.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学