精液细菌、真菌的实验室检查

睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等与精子生成、成熟或运输有关的器官发生感染可影响精子的数量与质量。常见引起生殖道感染的病原体有葡萄球菌、链球菌、肠球菌、肠杆菌科细菌、不动杆菌、乳杆菌、支原体、衣原体、非致病性奈瑟菌、念珠菌、病毒等。可取尿道口分泌物、前列腺按摩液、精液进行检查。

精液细菌、真菌的显微镜直接检查

一、精液标本的收集:按WHO标准,禁欲3~7天,采集前排小便,洗净双手,用0.01%的苯扎溴铵消毒尿道外口,用无菌生理盐水反复冲洗阴茎、阴囊,以手淫法将精液收集于无菌瓶中。

二、显微镜检查:精液、前列腺按摩液进行显微镜检查是检查精液是否染菌最常用的方法。

精液涂片、固定、革兰染色镜检:

  1. 革兰染色原理:革兰染色的结果取决于细菌细胞壁的结构:①G+菌:细胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。②G-菌:肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫-碘复合物溶出细胞壁,沙黄复染后呈红色。
  2. 试剂:①结晶紫(crystal violet)液:结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸铵水溶液80ml,将两液混匀置24小时后过滤即成。此液不易保存,如有沉淀出现,需重新配制。②碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加蒸馏水至300ml即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为浅黄色即不能使用。③95%乙醇。④稀释苯酚复红溶液:碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g,95%乙醇10ml,5%苯酚90ml混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液),取苯酚复红饱和液10ml加蒸馏水90ml即成。⑤番红溶液:番红O(safranine,又称沙黄O)2.5g,95%乙醇100ml,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
  3. 方法:革兰染色法包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤:①涂片固定;②草酸铵结晶紫染1分钟;③自来水冲洗;④加碘液覆盖涂面染1分钟;⑤水洗,用吸水纸吸去水分;⑥加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,30秒后水洗,吸去水分;⑦番红染色液(或沙黄)染10秒钟后,自来水冲洗。干燥,镜检。
  4. 结果:G-被染成蓝紫色,G+被染成淡红色。
  5. 注意事项:①新配制的染液应先用已知的G+菌和G-菌作对照,以检查染液质量。②革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,G+菌也可被脱色而染成G-菌;如脱色时间过短,G-菌也会被染成G+菌。

精液的抗酸染色镜检:

  1. 抗酸染色原理:分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与苯酚复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。
  2. 试剂:①苯酚复红液:称碱性复红4g,溶于95%乙醇100ml内,即成碱性复红饱和乙醇溶液。取该饱和溶液10ml,与50g/L的苯酚水溶液90ml混匀。②复染液:称亚甲蓝2g,溶于95%乙醇100ml中制成饱和溶液;再取该饱和溶液30ml加入蒸馏水100ml及100g/L的氢氧化钾水溶液0.1ml即成。③脱色液(3%盐酸乙醇):浓盐酸3ml 加95%乙醇97ml。
  3. 方法:夹住精液涂片,滴加苯酚复红染色,加温至有蒸汽出现,勿煮沸;染5分钟,流水冲洗,3%盐酸乙醇脱色;水洗后,亚甲蓝复染1分钟;水洗,干后,油镜检查。
  4. 结果:红色为抗酸性细菌,蓝色为非抗酸性细菌或细胞。
  5. 注意事项:苯酚复红加温染色过程中,温度不宜过高,勿使染料蒸干。

精液细菌、真菌的培养

常用细菌培养基

一、 血液琼脂(血平板)

  1. 成分:普通营养琼脂95ml,脱纤维羊血(或兔血)5ml。
  2. 配制:将已灭菌的普通营养琼脂(pH为7.6)加热熔化,冷却至50℃左右,以无菌手续加入纤维羊血(临用前置37℃水浴箱预温),轻轻摇匀(勿使有气泡),倾注于灭菌平皿内,每一平皿(直径9cm)20ml或分装试管,等凝固后,抽样置35℃培养,18~24小时,观察有无细菌生长,如无细菌生长,置4℃备用。

二、 巧克力色血琼脂(分离嗜血杆菌用)

  1. 成分:氯化钠2.5g,蛋白胨5.0g,牛肉粉2.5g,酵母浸膏2.5g,蒸馏水500ml(以上成分亦可用营养琼脂或哥伦比亚琼脂),氯化血红素15mg,25mg/ml万古霉素,7.5g/L辅酶A(NAD)。
  2. 配制:称取上述成分后,加蒸馏水溶解,用少量0.25mol/L氢氧化钠溶解氯化血红素后加入培养基,调pH7.8,高压灭菌,至60℃左右加入30ml羊血,置85℃水浴中摇动10~15分钟,冷至50℃左右加入上述浓度万古霉素、NAD各1ml。摇匀后倾注平板,抽样做无菌实验后,4℃保存备用。

三、麦康凯琼脂:分离革兰阴性杆菌用。称取麦康凯琼脂,加蒸馏水溶后,高压灭菌,倾注平皿。

四、罗氏培养基(改良):分离结核分枝杆菌。

  1. 成分:谷氨酸钠(99%以上)7.2g,磷酸二氢钾2.4g,硫酸镁0.24g,枸橼酸镁0.6g,甘油12ml,马铃薯淀粉30g,蒸馏水600ml,新鲜全蛋液1000ml,2%孔雀绿水溶液20ml。
  2. 配制:①基础液制备:量取蒸馏水600ml,加入各无机盐成分、谷氨酸钠和甘油,沸水浴使其溶解,自然冷却。②新鲜全蛋液制备:洗净新鲜鸡蛋表面,浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20~30分钟。取出,擦干,开口,收集鸡蛋液,搅匀。通过消毒的纱布过滤。③将600ml基础液和1000ml新鲜全蛋液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20ml,混匀,静置1小时后,分装至标准螺旋盖。

常用真菌培养基

沙保弱培养基:

  1. 成分:蛋白胨10g,琼脂20g,氯霉素0.1g,蒸馏水1000ml。
  2. 配制:上述成分混合,加热溶解分装,高压灭菌15分钟,倾注平皿。

念珠菌显色培养基:配制:称取柯玛素显色培养基,加蒸馏水后,高压灭菌,冷至50℃左右倾注平皿。

精液中常见细菌、真菌的鉴定

细菌培养:以无菌技术将待测精液接种于血平板、巧克力平板,或加上麦康凯平板。接种后的培养基置35℃温箱,在分离培养某些细菌(如淋病奈瑟菌)时,需将已接种的培养基置5%~10% CO2的环境。

  1. 淋病奈瑟菌:将精液接种于巧克力平板,5%~10% CO2的环境中35℃培养24~48小时后,取生长的可疑菌落涂片革兰染色,油镜下观察是否为革兰阴性,肾形成双排列,并取可疑菌落做氧化酶、糖发酵实验,并可进一步用荧光抗体实验等鉴定。对初步认定的菌落可先用头孢硝噻吩纸片检测β-内酰胺酶,并做规定的抗生素敏感实验。
  2. 革兰阴性杆菌:取平板上分离的纯菌落,革兰染色镜检为革兰阴性杆菌,按细菌生化鉴定程序操作,并进行药敏实验。
  3. 葡萄球菌:根据涂片、染色检查结果作血浆凝固酶、甘露醇发酵实验、耐热核酸酶实验、葡萄球菌A蛋白检测等。
  4. 链球菌:根据涂片、染色可见链状排列的革兰阳性菌。血平板培养有助于识别溶血特征,挑选可疑菌落进行血清学分类鉴定、杆菌肽、Optochin等实验鉴定。
  5. 厌氧菌培养:按厌氧菌培养的要求收集标本,并立即送厌氧培养。
  6. 结核分枝杆菌培养:标本收集后,自行液化接种于罗氏培养基,置35℃培养约2个月,培养期间每周观察结果。发现可疑菌落,作涂片抗酸染色确认。
  7. 真菌培养:取精液接种于沙保弱培养基或念珠菌显色培养基进行培养鉴定。

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