精液细菌和真菌的显微镜检查

一、体征与症状

来男科门诊就诊的患者,病史询问中应特别注意以往有无泌尿生殖道感染史,有无性生活紊乱或不洁性生活史,家庭成员及本人有无结核病史等。平时有无阴囊或会阴不适、排尿刺激症状及尿道有分泌物等。男性生殖道感染的体征不明显,慢性感染或急性感染后的体征可以很轻或没有,体检时应加以注意。

二、精液标本的收集

清洁尿道外口(包皮过长者应翻起),用无菌生理盐水反复冲洗阴茎、阴囊和双手,再用碘伏及75%乙醇消毒。用手淫法将精液射入无菌瓶中,液化后一式2份,分别用于显微镜检查和细菌培养。

三、显微镜检查

对精液、前列腺按摩液(EPS)进行显微镜分析是检查精液是否染菌最常用的方法。

1.精液涂片显微镜直接检查

精液是前列腺液、附睾液、精囊液及尿道球腺液等的混合液。因此,这些部位的感染都可以引起精液中白细胞增多。精液中的白细胞与未成熟的生精细胞难以区别,虽然WHO推荐的过氧化物酶染色方法可以区分白细胞与未成熟生精细胞,但该技术依赖于内源性过氧化物酶,淋巴细胞不显示过氧化物活性,单核细胞仅显示弥散的胞质染色。多形核白细胞的内源性过氧化物酶活性取决于该细胞的年龄和条件、涂片的新鲜程度,并且随严重感染而丧失。因为感染本身就可以耗竭内源性过氧化物酶。黄宇烽等介绍瑞-吉染色法和用抗全白细胞的CD45单克隆抗体染色区分白细胞和生精细胞,该法直观容易识别。

2010年,WHO组织制定的精液正常参考值,提出了正常精液中白细胞少于1×106/ml。Woff(1988年)等运用过氧化物酶结合单克隆抗体试剂对精液中的白细胞及其亚群进行了评价分类,发现精液中的白细胞包括中性粒细胞、巨噬/单核细胞和淋巴细胞,而淋巴细胞主要为T细胞,每毫升精液中白细胞计数大于100万的不育患者称为白细胞精子症(leukocytospermia)。过去认为白细胞精子症即等于附属性腺炎症,当然并不排除急性附属性腺炎症时精液中会出现大量的白细胞。但现在的研究已证实两者之间并无直接的关系。例如精液中白细胞与细菌等的存在无明显相关性。可能有多种潜在的因素可以成为精液中白细胞增加的原因,如吸烟或酗酒相关的生殖道局部炎症性变化,也可以使精液中白细胞升高。ELDemiry等发现,精液中的巨噬细胞很可能还能发挥一些正常的生理功能,如抵抗外来微生物的感染,吞噬退化的细胞残体,破坏并清除凋亡或未成熟的生精细胞。

最近,Hill等提出不育男性精液中大量出现的白细胞及其产物主要是干扰精子运动、妨碍精子成熟、降低精子浓度和影响穿透卵子的能力。

2.精液涂片、固定、革兰染色及抗酸染色镜检

革兰染色法

(1)试剂:①结晶紫染液:称结晶紫4g,溶于95%乙醇100ml中,制成饱和液;再取饱和液10ml与10g/L的草酸铵溶液90ml混合即成。②碘液:先溶碘化钾2g于10ml蒸馏水中,再加碘1g;待碘全部溶解后,加蒸馏水200ml即成。③脱色剂:95%乙醇或丙酮乙醇溶液(95%乙醇70ml加丙酮30ml)均可应用。但后者较单用95%乙醇好,易于掌握,反应准确。④复染液:可用稀释石炭酸复红液(取萋-尼抗酸染色液中的石炭酸复红液10ml,加蒸馏水90ml即成)或沙黄溶液(25g/L的沙黄乙醇溶液10ml,加蒸馏水90ml)。

(2)操作:将结晶紫液滴加在已固定的涂片上,染1min后,流水冲洗;滴加碘液1min后水洗,再用脱色剂脱色,摇动玻片至紫色不再脱落为止;水洗;加稀释石炭酸复红液染0.5~1min;流水冲洗,晾干后镜检。

(3)结果:精液涂片中革兰阳性菌染成紫色,革兰阴性菌染成红色。

四、注意事项

新配制的染液应先用标准的革兰阳性菌和阴性菌株(如金黄色葡萄球菌ATCC25923与大肠埃希菌ATCC25922)作对照,以检查染液的质量。结晶紫与草酸铵溶液混合后不能保存太久,如有沉淀出现应重新配制。

抗酸染色法

(1)试剂 ①Zieh-Neelsen石炭酸复红液:称碱性复红4g,溶于95%乙醇100ml内,即成碱性复红饱和乙醇溶液。取该饱和液10ml,与50g/L的石炭酸水溶液90ml混匀即成。②脱色剂:取浓盐酸3ml加95%乙醇97ml,混匀。③Loeffler碱性美蓝溶液;称美蓝(亚甲蓝)2g,溶于95%乙醇100ml中制成饱和液;再取饱和液30ml加入蒸馏水100ml及100g/L的氢氧化钾水溶液0.1ml即成。

(2)操作 用片夹夹住精液涂片,滴加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现,切勿煮沸;染5min后,流水冲洗;滴加脱色剂,不时摇动玻片至无红色脱落为止;水洗后以碱性美蓝复染1min;水洗,干后,油镜检查。

(3)结果 抗酸杆菌染成红色,非抗酸菌或细胞均染成蓝色。

(4)注意事项 石炭酸复红加温染色过程中,温度不宜过高,切勿使染料沸腾和蒸发干;如急于观察结果,可将染色后标本用吸水纸平铺于玻片上,轻压吸干,但用过的吸水纸上可能沾有极少量染色的抗酸杆菌,故不宜再用于吸干第二份标本,以免发生错误诊断。

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