精浆α-葡糖苷酶的检测

精浆α-葡糖苷酶来源于附睾(中性α-葡糖苷酶)和前列腺(酸性α-葡糖苷酶),前者约占80%,后者约占20%。因此,精浆α-葡糖苷酶的检测目前有两种方法,一是精浆总α-葡糖苷酶的检测,为目前我国男科实验室常用方法;二是精浆中性α-葡糖苷酶的检测,为WHO手册推荐方法,检测过程相对比较繁琐。临床意义:精浆总α-葡糖苷酶活性高低可反映附睾分泌功能。

精浆总α-葡糖苷酶的测定

一、检测原理

使用葡萄糖氧化酶法检测精浆总α-葡糖苷酶活性。麦芽糖含有两个吡喃型葡萄糖残基,由α-1,4-糖苷键相连,经精浆α-葡糖苷酶的作用,水解糖苷键生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法可测定其生成量。1单位α-葡糖苷酶定义为每毫升精浆与底物在37℃水浴箱中温育30min产生0.1mg葡萄糖。

二、所用试剂

  1. 醋酸盐缓冲液:0.1mol/L pH5.2。
  2. 麦芽糖基质液(56mmol/L):称取麦芽糖100mg,溶于5ml 0.1mol/L醋酸盐缓冲液中,用时新鲜配制。
  3. Tris-HCl缓冲液:0.5mol/L pH7.0。
  4. 葡萄糖标准液:5.56mmol/L。
  5. 153.06mmol/L氯化钠溶液。
  6. 葡萄糖氧化酶法测定试剂盒:市场广泛可得。

三、操作步骤

具体操作步骤见下表。

精浆α-葡糖苷酶测定操作步骤

精浆α-葡糖苷酶测定操作步骤

 

混匀,37℃水浴箱中温育15min后,用505nm波长,Bp管调零,读取吸光度值。结果计算:精浆α-葡糖苷酶活性(U/ml)=(U-Ub-Rb)/(S-Rb)×0.01×2×1/0.01÷0.1=(U-Ub-Rb)/(S-Rb)×20。

四、正常参考值

正常生育男性精浆总α-葡糖苷酶活性参考值为35.1~87.7U/ml。

精浆中性α-葡糖苷酶的测定

一、检测原理

前列腺分泌的酸性α-葡糖苷酶能够被十二烷基硫酸钠(SDS)选择性抑制,检测过程中加入SDS后,检测出的α-葡糖苷酶活性即为中性α-葡糖苷酶活性。WHO推荐的该检测方法原理为葡糖苷酶将合成的p-硝基苯酚-α-吡喃葡糖苷(PNPG)底物转化为对硝基苯酚(PNP),加入碳酸钠后变为黄色,然后在405nm下比色测定,通过与标准曲线的比较确定样本中中性α-葡糖苷酶活性。1IU葡糖苷酶活性定义为37℃水浴箱中温育每分钟生成1μmol PNP。

二、所用试剂

  1. 缓冲液1(0.2mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.8):溶解4.56g K2HPO4于100ml纯水中;溶解2.72g KH2PO4于100ml纯水中。将两者等量混合至pH6.8。
  2. 缓冲液2:溶解1g SDS于100ml缓冲液1中。
  3. 显色剂1(0.1mol/L Na2CO3):溶解6.20g Na2CO3•H2O于500ml纯水中。
  4. 显色剂2:溶解0.1g SDS于100ml显色剂1中。
  5. 5mg/ml底物PNPG:溶解0.1g PNPG于20ml缓冲液2中,并在50°C的加热板上搅拌约10min。一些晶体可能仍然不溶解。使用过程需将溶液贮存于37℃水浴箱中。每次分析制备新鲜溶液。
  6. 用于精液空白的葡糖苷酶抑制剂(澳粟精胺,10mmol/L):溶解18.9mg澳粟精胺于10ml纯净水中,用纯净水稀释10倍成1mmol/L的工作液,分装成1ml-20℃冻存。
  7. 用于产物PNP的标准曲线溶液(5mmol/L):溶解69.5mg PNP于100ml纯净水中,必要时加热溶解。用铝箔包裹或装在棕色玻璃瓶中4℃避光保存,每3个月制备新鲜的标准溶液。
  8. 制备标准曲线的溶液(在孵育的最后一个小时内完成):加400μl 5mmol/L PNP贮存液于10ml试管中,加显色剂2(200μmol/ L)至10ml,用显色剂1稀释200μmol/L标准得到4个标准液,160、120、80和40μmol/L PNP。
  9. 用冻融的混合精浆做室内质量控制。

三、操作步骤

基本操作步骤为:

  1. 精液分析后3000g离心剩余的精液样本15min,取去精子的精浆贮存于-20℃待分析。
  2. 溶解去精子的精浆并充分混匀,同时溶解用于内部质量控制的混合精浆。
  3. 在2个1.5ml试管中用正向移液器分别加15μl精浆标本,同时设两个空白(15μl纯水)和4份(各15μl)内部质量控制精浆样本。
  4. 在两个内部质量控制样本中加8μl 1mmol/L澳粟精胺以提供精浆空白值。
  5. 加100μl PNPG底物溶液至每管中,混匀每管,37℃孵育2h。
  6. 2h后加1ml显色剂1并混匀终止孵育。
  7. 将250μl样本和标准液转移至96孔板中;1h内在405nm波长下用水空白调零读取结果。
  8. 通过比较吸光度值,从标准曲线上读取标本产生的PNP浓度。
  9. 乘以校正因子[为0.6194,即经过120min反应,在1.115ml总体积中,从15μl精浆得出的活性,因此,校正因子为(1115/15)/120=0.6194],得到未稀释精浆中性α-葡糖苷酶活性(IU/L),再乘以精液总体积即为每份精液的α-葡糖苷酶活性(mU)。

四、正常参考值

正常生育男性精浆中性α-葡糖苷酶为每次射精精液≥20mU。

方法学评价

精浆总α-葡糖苷酶活性的测定包含约20%的来自前列腺的酸性α-葡糖苷酶,因此其总活性值可能受到前列腺分泌功能的影响,但其操作简便,影响因素少。而WHO推荐的中性α-葡糖苷酶活性检测中,由于SDS溶液储存很容易发生沉淀,且用于检测的底物PNPG常有结晶难以溶解,这给实际操作带来很大的不确定性,而且,其操作步骤较为繁琐,且每次分析均需制备标准曲线,十分费时,不易在临床推广。

为了保证精浆α-葡糖苷酶活性检测结果的准确可靠,应注意三点:①离心分离获得精浆标本时,至少3000g离心15min。WHO推荐的离心速度为1000g离心10min,但以此离心速度分离获得的精浆中仍含有大量精子,其检测出的α-葡糖苷酶活性显著高于3000g离心15min获得的精浆。这可能与精浆中残存的精子、细胞或非细胞成分有关,因为精子顶体中含有α-葡糖苷酶,前列腺分泌的非细胞组分中亦含有α-葡糖苷酶。②精浆总α-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关。禁欲时间越长,α-葡糖苷酶水平越高。禁欲4~5d和禁欲6~7d的结果之间没有显著性差异,而禁欲2~3d的精浆α-葡糖苷酶水平明显降低,禁欲7d以上的精浆α-葡糖苷酶水平明显升高。③每批精浆α-葡糖苷酶活性的检测中均应包括高、低浓度的两种室内质控品,这可通过混合精浆分装冷藏获得。而且,每次更换新的不同批次的试剂时,应以质控品结果作为参考,结果的一致性应在10%之内。

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